间日疟原虫(Plasmodiumvivax)是全球地理分布最为广泛的人体疟原虫种,也曾是我国疟疾流行区的主要疟原虫种。由于间日疟原虫具有独特的生物学特性,间日疟的控制和消除比恶性疟难度更大,在大多数恶性疟和间日疟混合流行地区,常发现在疟疾控制取得成效,疟疾发病率下降的同时,间日疟所占的比例却在增加,一些国家在恶性疟得到有效控制或消除后的几年甚至几十年内仍存在间日疟的流行。当前我国已进入消除疟疾阶段,虽然除云南边境地区外,我国大部分原疟疾流行地区已无本地感染疟疾病例,但我国每年由境外输入的疟疾病例超过3000例,其中输入性间日疟约占20%-25%。世界卫生组织消除疟疾的考核评估判定标准之一是“连续3年没有本地蚊媒传播的疟疾病例”,由于我国原主要疟疾流行区的媒介按蚊均能传播间日疟,因此在发现间日疟病例后,不仅需要判定其是否为输入性病例,还需要评估是否存在输入再传播风险的可能。目前,在我国消除疟疾行动计划中,输入性疟疾病例的判定仍依赖于个案流行病学调查,所有存在媒介按蚊地区发现的输入性间日疟疫点均认为有再传播风险,需要采取包括媒介控制在内的疫点处置措施。因此,探索研究判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别技术和境外输入性疟原虫株与本地疟疾传播媒介之间的适配性(易感性),并评估输入性疟疾病例引起本地继发传播的风险,对消除疟疾和消除后的防止输入再传播均具有重要意义。本研究结合我国消除疟疾阶段的实际需求,第一部分采用微卫星分子标记对我国中部和南部地区的间日疟原虫株进行了基因多态性和群体遗传学分析,并对我国与其它国家间日疟原虫株的基因型数据进行了比较分析,探索判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别方法;第二部分通过对我国不同地区间日疟原虫株的Pvs47基因多态性和群体遗传学研究以及与东亚、东南亚和南美地区间日疟原虫株Pvs47基因序列的比较分析,为输入性间日疟引起本地传播风险评估提供科学依据。第一部分基于微卫星标记的间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究一、中国中部和南部地区间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构分析目的:对我国中部地区和南部地区间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行分析,为建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术提供依据。方法:收集2007-2012年我国中部和南部间日疟流行区的间日疟原虫样本(n=236),采用9个微卫星分子标记和毛细管电泳技术进行基因分型,利用亚太地区消除疟疾组织(Asia Pacific Malaria Elimination Network,APMEN)间日疟原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN)进行数据处理,对间日疟原虫的多克隆感染情况、群体基因多态性、连锁不平衡水平和群体遗传结构进行分析。结果:1.南部地区间日疟原虫株多克隆感染比例(70.4%,38/54)高于中部地区(51.4%,93/181),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株的平均期望杂合度(HE=0.85±0.07)高于中部地区(HE=0.73±0.13),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株等位基因丰度(Rs=11.89)高于中部地区间日疟原虫株等位基因丰度(Rs=8.17),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株各微卫星位点的平均等位基因数和特有等位基因数均多于中部地区。2.中部地区间日疟原虫株(/AS=0.147,P<0.01)和南部地区间日疟原虫株(/AS=0.136,P<0.01)均存在明显的连锁不平衡,且中部地区高于南部地区。中部地区不同年份的间日疟原虫株也具有明显的连锁不平衡,且连锁不平衡水平从2008 年(IAS=0.137,P<0.01)、2009 年(/AS=0.190,P<0.01)到 2010 年(IAS=0.264,P<0.01)有逐年增加的趋势。3.STRUCTURE分析结果显示中部地区和南部地区的间日疟原虫株可分为多个遗传亚群。K=4时,ΔK值最大,中部地区群体遗传结构复杂,南部地区群体遗传结构较为单一。K=2时,南部地区92.59%(50/54)的虫株来源于遗传亚群2(pop2),1.85%(1/54)的虫株来源于遗传亚群1(popl),5.56%(3/54)的虫株为混合来源;中部地区43.09%(78/181)的虫株来源于遗传亚群1(pop1),34.81%(63/181)的虫株来源于遗传亚群2(pop2),22.1%(40/181)的虫株为混合来源。4.中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化(FST=0.0696,P=0.00007)。中部地区2008年与2010年之间的间日疟原虫株群体遗传分化最大(FST=0.0389,P=0.012),2008 与 2009 年(FST=-0.0001,P=0.422),2009与2010年(FST=0.034,P 0.034)之间的遗传分化较小。5.进化树和主成份分析均显示中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉。Mantel检验分析显示,中部地区间日疟原虫株的遗传距离与地理距离之间具有一定的相关性(r=0.08,P=0.036),遗传距离与样本采集时间之间也具有一定的相关性(r=0.05,P=0.01)。结论:1.我国南部地区间日疟原虫株的基因多态性在个体水平(多克隆感染)和群体水平(期望杂合度)上均显著高于我国中部地区,与我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区的情况较为吻合。2.我国中部地区和南部地区的间日疟原虫株均具有明显的连锁不平衡,且南部地区的连锁不平衡水平低于中部地区,同样提示我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区。3.我国中部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为复杂,南部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为单一;中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化;中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉;中部地区间日疟原虫株之间的遗传距离具有一定的时空相关性。4.建立了我国中部地区和南部地区间日疟株微卫星基因型数据库,并纳入了亚太地区消除疟疾组织(APMEN)间日疟原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN),为进一步开展间日疟原虫感染来源分子鉴别技术的研究打下了基础。二、我国与其它国家间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构比较分析目的:对我国与其它国家间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,探索建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术。方法:通过国际合作,利用APMEN间日疟原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN),对埃塞俄比亚、伊朗、不丹、马来西亚、印度尼西亚、韩国、中国南部地区以及中国中部地区的间日疟原虫株进行基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,并基于STRUCTURE和Weka软件对境外输入性间日疟病例进行感染来源分析。结果:1.不同国家之间的间日疟原虫株多克隆感染比例差异较大(4.2%-97.2%),伊朗间日疟原虫株的多克隆感染比例最高(97.2%),韩国间日疟原虫株的多克隆感染比例最低(4.2%)。中国中部地区和南部地区间日疟原虫株的多克隆感染比例均较高,分别为51.4%和70.4%。2.共发现78个特有等位基因,其中特有等位基因个数最多的为印度尼西亚(25个),最少的为韩国(0个),中国中部地区发现7个特有等位基因,中国南部地区发现10个特有等位基因。微卫星位点MS20的短片段等位基因(150bp)仅在中国和韩国的间日疟原虫样本中发现,其在韩国、中国中部地区和中国南部地区的等位基因频率分别为98.8%、60.9%和22.4%。3.群体遗传结构STRUCTURE分析结果显示,K=2时,间日疟原虫株的2个遗传亚群与间日疟原虫热带株和温带株的地理分布相吻合;K=4时,非洲虫株主要属于pop1,伊朗虫株主要属于pop2,不丹、马来西亚、印度尼西亚以及中国南部地区虫株主要属于pop3,中国中部地区和韩国的虫株主要属于pop4;K=6时,中国中部地区和韩国的间日疟原虫株也出现了遗传结构分化。进化树和主成份分析均发现,中国中部地区间日疟原虫株与韩国株的遗传距离相近,可聚为一类,但与非洲和东南亚的间日疟原虫株的遗传距离较远;我国南部地区间日疟原虫株与东南亚国家的间日疟原虫株之间的遗传距离较为接近。4.基于STRUCTURE分析,对30例输入性间日疟病例感染来源判定的平均符合率为85%。我国中部地区的间日疟原虫株与埃塞俄比亚间日疟原虫株可分为2个遗传亚群(pop1和和pop2),埃塞俄比亚间日疟原虫株98.20%的遗传信息来自pop1,而中国中部地区间日疟原虫株的96.3%遗传信息来自pop2,5例有埃塞俄比亚旅行史间日疟病例均可判定为pop1来源。中国中部地区间日疟原虫株和东南亚(马来西亚和印度尼西亚)间日疟原虫株也可分为2个遗传亚群(pop1和pop2),东南亚间日疟原虫株97.50%的遗传信息来自popl,中国中部地区间日疟原虫株94.20%的遗传信息来自pop2,10例有东南亚旅行史的间日疟病例中,9例可判定为pop2来源,判定准确率为90%。5.基于Weka分析,采用4个微卫星位点(MS8,MS10,MS16,MS20)对来自非洲、中东、南亚/东南亚和东亚4个地区的493例间日疟病例感染来源分类的符合率为90.47%,对中国中部地区和埃塞俄比亚的172例间日疟样本感染来源分类的符合率达99.42%;采用2个微卫星位点组合(MS8,MS20)对中国中部地区和东南亚的235例间日疟样本来源分类的符合率达98.70%。结论:1.首次发现我国中部地区存在间日疟原虫微卫星MS20位点短片段(150bp)等位基因,该间日疟原虫地理株特有等位基因可作为我国中部地区本地和输入性间日疟鉴别的分子标记。2.初步建立了以微卫星位点为基础的不同感染来源间日疟原虫分子鉴别技术。采用4个微卫星位点(MS8,MS10,MS16,MS20)对中国中部地区和非洲间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达99.42%;采用2个微卫星位点(MS8,MS20)对中国中部地区和东南亚国家间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达98.70%。第二部分间日疟原虫Pvs47基因多态性和群体遗传学研究目的:研究不同地区间日疟原虫株Pvs47基因多态性和群体遗传学特征,为输入性间日疟病例本地传播风险评估提供科学依据。方法:对我国中部地区、南部地区以及部分从东南亚国家输入的间日疟原虫株(n=212)进行Pvs7 基因测序,与 Genbank(n=76)和 PlasmoDB(n=68)数据库中已报道的间日疟原虫株Pvs47基因序列一起构建数据库,并进行基因多态性和群体遗传学分析。结果:1.对356例间日疟原虫株的Pvs47基因序列进行分析,共发现34个单核苷酸多态性位点。Pvs47平均核苷酸多样性指数π为0.0039,其中东南亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最高(π=0.00424),东亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最低(π=0.00029),我国中部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(π=0.00091)略高于东亚地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(π=0.00029),但明显低于我国南部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(π=0.00253)。2.东亚与南美间日疟原虫种群之间的遗传分化最大(FST=0.92,GST=0.60),我国中部地区与东亚间日疟原虫种群之间的遗传分化最小(FST=0.06,GSt=0.04)。我国南部地区与东南亚间日疟原虫种群之间的遗传分化较小(FST=0.08,GST=0.03),但我国中部地区与东南亚间日疟原虫种群之间的遗传分化较大(FST=0.37,GST=0.20)。3.共发现52个Pvs47DNA单体型和47个Pvs47氨基酸单体型。47个氨基酸单体型中,东南亚的单体型最多(28个),东亚的单体型最少(3个),中国中部和南部地区的单体型分别为12个和11个。每个间日疟原虫种群均存在特有氨基酸单体型(1-21个),在频率大于1%的特有单体型中,东南亚1个(Hap_aa40),我国南部地区 1 个(Hap_aa8),南美 2 个(Hap_aa1 和 Hap_aa45)。Hap_aa2 是我国中部地区和东亚的优势氨基酸单体型,分别占我国中部地区间日疟原虫株的80%(112/140)和东亚间日疟原虫株的95.1%(39/41),而东南亚地区Hap_aa2仅占3.0%(2/67),我国南部地区Hap_aa2占28.9%(13/45),南美未发现Hap_aa2。Hap_aa1是南美的优势单体型,占南美间日疟原虫株的74.6%(47/63),其它地区均未发现Hap_aa1。4.遗传进化树分析显示,47个氨基酸单体型可分为2个主要的遗传进化枝。其中,进化枝1中的10个单体型主要在我国中部地区流行,进化枝2中的23个单体型主要在东南亚地区流行。7个在我国南部地区流行的单体型在2个进化枝中均有发现,1个东亚特有单体型与我国中部地区的单体型聚为一枝,4个南美特有单体型均位于进化枝2,且遗传地位相近。5.Network分析显示,Pvs47DNA单体型分布具有明显的地理来源聚集性。我国中部地区和东亚的单体型聚为一类,我国南部地区和东南亚的单体型聚为一类,南美的单体型聚为一类。结论:1.首次发现不同地区间日疟原虫株Pvs47基因的基因多态性和群体遗传结构存在明显差异,Pvs47单体型具有地理来源特异性。2.我国南部地区间日疟原虫株与东南亚间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位相近,单体型聚为一类,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性强,近距离输入病例引发本地传播的风险较大。3.我国中部地区间日疟原虫株与东南亚等地区间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位较远,单体型具有地理来源特异性,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性较差,远距离输入病例引发本地传播的风险较小,这可能是由东南亚国家和非洲输入的间日疟病例尚未在我国中部地区引起输入再传播的重要分子机制之一。