论文部分内容阅读
研究背景：前列腺癌高居欧美男性恶性肿瘤发病率榜首,男性恶性肿瘤死亡率第二位。前列腺癌的发病率在我国虽然较西方国家低,但是发病率逐年上升的趋势十分明显,严重危害着中老年男性的健康。因此前列腺癌的预防和治疗一直是泌尿外科研究的重点与热点之一。许多国内外流行病学及实验室研究已经发现,茶的摄入习惯与我国前列腺癌发病率一直偏低有密切关系,而饮茶等生活习惯的改变,也与我国前列腺癌发病率的变化趋势高度相关。茶及其提取物在前列腺癌的发生发展中起到了重要作用。茶叶中的主要成分是茶多酚,EGCG又是茶多酚中的主要单体成分。大量研究证实茶多酚对前列腺癌、皮肤癌、胃癌、食道癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等人体大多数肿瘤的发生发展有抑制作用。但目前茶及其提取物(主要是EGCG)对前列腺癌的作用机制尚不明了,许多研究也正将EGCG作为前列腺癌化学防治的重要研究方向。有相关文献指出,茶的抗癌作用可能是多重的,包括诱导凋亡,周期阻滞,抑制肿瘤侵袭和转移,抗氧化作用、抑制端粒酶活性和信号传导调控等方面。胰岛素样生长因子系统(Insulin-like growth factor system,IGFS)包括2种多肽类激素(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ),多种细胞膜受体(如IGF-IR),以及至少6种结合蛋白(IGFBPs), IGFS信号通路也在多种肿瘤的发生发展中起着十分关键的作用。其家族中的数种血清因子在肿瘤患者血清中的水平都有异常改变,家族中的数种蛋白也在多种肿瘤组织和细胞中过度表达,这些既可以作为肿瘤发生的诊断标记,也可以作为具有广泛前景的肿瘤治疗靶点。有研究提示,EGCG对IGF信号通路系统也有多种重要作用。为了研究EGCG的抗前列腺癌作用,了解其抗癌机制与IGF信号通路系统的关系,我们提出如下假说：EGCG可以通过抑制人胰岛素样生长因子(IGF)信号通路,减少细胞自分泌IGF量等机制发挥作用,调节IGF系统下游癌基因的表达,从而促进癌细胞凋亡,抑制癌细胞生长,起到抗癌作用。我们用ELISA法检测了IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ在正常人、良性前列腺增生及前列腺癌患者血清中含量的情况,并通过体外实验观察EGCG对人前列腺癌PC3细胞的抑癌作用,并从EGCG对IGF信号通路系统的调控方式方面对其抗前列腺癌作用机制进行深入研究。目的：探讨IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ在前列腺癌患者血清中的含量水平及其意义。方法：用酶联免疫法(ELISA)检测IGF-Ⅰ在28例前列腺癌患者、20例前列腺增生患者及20例正常健康男性血清中的含量情况,并分析其可能的临床意义。结果：前列腺癌组患者血清IGF-Ⅰ水平(491.6±74.1ng／ml)高于前列腺增生(296.0±87.8ng／ml)组(P<0.05),也高于正常对昭(232.1±95.7ng／ml)组(P<0.05)。前列腺癌组患者血清IGF-Ⅱ水平(257.7±62.9ng／ml)高于前列腺增生(161.0±52.4ng／ml)组(P<0.05)及正常对照(160.8±59.2ng／ml)组(P<0.05)。高危组前列腺癌患者血清IGF-Ⅱ水平(298.7±41.8ng／ml)高于低危组前列腺癌患者血清IGF-Ⅱ水平(203.5±48.3 ng／ml),两者的差异有统计学意义(P<0.05)。高危组前列腺癌患者IGF-Ⅰ水平(500.1±57.8ng／ml)比低危组前列腺癌患者IGF-Ⅰ水平(480.2±96.6ng／ml)稍高,但两者之间并无明显统计学差异(P>0.05)。前列腺增生组与正常对照组比较,IGF-Ⅰ水平及IGF-Ⅱ水平统计学差异均无显著性(P>0.05)。结论：1.血清IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ水平的升高可能增加了前列腺癌的危险性,血清IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ水平的检测可以作为一个新的检测指标预测高危人群,进行早期诊断；2.血清IGF-Ⅱ水平与前列腺癌临床进展危险程度有关,血清IGF-Ⅱ水平的检测对评价前列腺癌临床进展风险、判断前列腺癌患者预后等均有一定意义。目的：探讨EGCG对人前列腺癌PC3细胞体外生长的影响。方法：设定不同浓度的EGCG作用于PC3细胞不同时间后,利用MTT法检测对细胞增殖的作用,流式细胞术检测PC3细胞的凋亡指数情况。与EGCG以不同的组合方式加入外源性IGF-Ⅰ/IGF-Ⅱ刺激PC3细胞,观察对PC3细胞增殖及凋亡的影响结果：MTT法检测EGCG (0,20,40,60ng/ml)作用于PC3细胞后对细胞增殖的作用,20ng/ml EGCG对PC3细胞作用24h后即可显著抑制人前列腺癌PC3细胞的生长(P<0.001),细胞平均抑制率为27.7%,细胞存活率随培养时间的延长而降低,20ng/ml EGCG时24h,48h,72h细胞平均存活率分别为72.3%,52.5%,44.6%,EGCG对细胞增殖的抑制呈现明显的时间效应关系,在其它浓度组也有同样表现。在同一时间段内,随EGCG作用浓度的增加,各组细胞的存活率也逐渐下降,20,40,60ng/ml EGCG作用24h后细胞平均存活率分别为72.3%,68.2%,50.3%,呈明显的剂量效应关系,在其它时间组也有同样表现。外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ作用于PC3细胞后,可以明显刺激细胞增殖。EGCG可以阻断外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。流式细胞术检测细胞凋亡率,不同浓度组EGCG作用PC3细胞24h,对照组的细胞早期凋亡率是(1.37±0.006)%,EGCG处理20ng/ml组的凋亡率是(2.82±0.018)%,40ng/ml处理组的凋亡率是(3.45±0.022)%,60ng/ml处理组的凋亡率是(5.25±0.024)%;各浓度组与对照组的细胞凋亡率相比差异性显著(P<0.05),并各组之间也有显著差异,呈明显剂量依赖性关系(P<0.05)。EGCG作用时间延长至48h,72h后,凋亡率也随之进一步增加,均与对照组相比有显著差异(P<0.05),且在同一EGCG作用浓度下,EGCG诱导凋亡能力也呈明显时间依赖性关系。外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ作用于PC3细胞后,可以明显抑制细胞凋亡。EGCG可以阻断外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。结论：1.EGCG作用于PC3细胞后,对PC3细胞的生长有明显抑制作用,并且呈明显的剂量效应关系及时间效应关系。2.EGCG作用于PC3细胞后,明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量效应关系及时间效应关系3.外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ作用于PC3细胞后,可以明显刺激细胞增殖,抑制细胞凋亡。EGCG可以阻断外源性IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的作用。目的：探讨EGCG抑制人前列腺癌PC3细胞的分子生物学机制与IGF信号系统的关系。方法：设定不同浓度EGCG作用于PC3细胞不同时间,收集细胞培养上清液测定IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ的含量水平。再设20ng/ml EGCG与15μM IGF-Ⅰ或15μM IGF-Ⅱ以不同组合共同作用于PC3细胞,半定量RT-PCR检测PC3细胞的IGF-Ⅰ, IGF-ⅡmRNA的变化,Western blot检测p-IGF-ⅠR、p-AKT蛋白的表达。结果：PC3细胞培育24h后,培养上清液中有IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ分泌,IGF-Ⅰ稳定在(109.9±6.6ng/ml), IGF-Ⅱ浓度为(76.1±2.3ng/ml)。20ng/ml EGCG作用24h可以使自分泌的IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ明显减少(P＜0.05),随着EGCG作用浓度增加及作用时间延长,PC3细胞自分泌IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ随之减少,呈显著的剂量效应关系及时间效应关系。半定量RT-PCR检测,IGF-ⅠmRNA表达比值(IGF-Ⅰ/GAPDH)分别为,空白对照组：0.623±0.045,IGF-Ⅰ组：0.443±0.015,IGF-Ⅰ组：0.193±0.031,IGF-Ⅰ+EGCG组：0.670±0.050,IGF-Ⅱ+EGCG组：0.193±0.021,EGCG组：0.193±0.038。EGCG处理组IGF-ⅠmRNA表达明显下调(P<0.01),IGF-Ⅰ+EGCG及IGF-Ⅱ+EGCG处理组亦明显下调(P<0.05)。IGF-ⅡmRNA表达比值(IGF-Ⅱ/GAPDH)分别为,空白对照组：0.216±0.052,IGF-Ⅰ组：0.294±0.041,IGF-Ⅱ组：0.260±0.014,IGF-Ⅰ+EGCG组：0.117±0.030,IGF-Ⅱ+EGCG组：0.108±0.033,EGCG组：0.097±0.021。IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ处理组与空白对照组比较,IGF-ⅡmRNA表达明显上调(P<0.05),EGCG处理组则表达明显下调(P<0.01),IGF-Ⅰ+EGCG及IGF-Ⅱ+EGCG处理组IGF-ⅠmRNA表达亦明显下调(P<0.01)。Western blot检测PC3细胞内的p-IGF-1βR及p-Akt蛋白的表达,IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ组的p-IGF-1βR表达均较空白对照组明显上调(P<0.05),EGCG组p-IGF-1βR蛋白表达水平较空白对照组下调(P<0.05),即使在外源IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的刺激作用下,该下调作用仍十分明显(P<0.05)。IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ组p-Akt表达均较空白对照组上调,但无统计学意义(P>0.05),EGCG组p-Akt蛋白表达水平下调降低(P<0.05),即使在外源IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的刺激作用下,该下调作用仍十分明显(P<0.05)。结论：1.人前列腺癌PC3细胞生长过程中可以向细胞培养基分泌IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ, EGCG可以减少PC3细胞IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的自分泌水平,并呈明显时间和剂量效应关系。2.人前列腺癌PC3细胞的IGF-ⅠmRNA及IGF-ⅡmRNA表达能被EGCG所抑制,外源性IGF-Ⅱ可以刺激PC3细胞IGF-ⅠmRNA及IGF-ⅡmRNA表达上调,并且该刺激作用可以被EGCG所阻断。3.外源性IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ可以上调IGF信号通路系统中的关键因子p-IGF-1βR的蛋白及p-Akt蛋白表达,EGCG可以抑制PC3细胞的p-IGF-1βR及p-Akt蛋白表达,并且可以阻断外源性IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ对的p-IGF-1βR及p-Akt蛋白表达的上调刺激作用。