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实验目的SIN3A是转录抑制复合体SIN3A/HDAC的核心组分,通过其组蛋白去乙酰化酶活性降低细胞内组蛋白乙酰化水平从而调控基因的表达,参与到许多生物学过程中,例如细胞增殖、细胞凋亡、分化、哺乳动物发育和体内稳态调节等。但是SIN3A/HDAC复合体在乳腺癌发生发展中所发挥的生物学功能仍不够明确,为了进一步探究其在乳腺癌发生发展中的相互作用蛋白及机制,我们进行了以下研究。实验方法1.在乳腺癌MCF-7细胞系中稳定表达FLAG-SIN3A的质粒,通过免疫亲和纯化和银染质谱测序分析鉴定SIN3A的体内相互作用蛋白,并用蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和快速蛋白液相色谱对上述的蛋白之间相互作用进行验证。采用GST pull-down实验探究直接相互作用蛋白的机制,并利用体外酶活性实验分析复合体的酶活性。2.在乳腺癌MCF-7细胞中利用Ch IP-on-chip在全基因组范围内寻找出LSD1/SIN3A/HDAC复合体可能的共同调控的下游靶基因,通过KEGG对这些靶基因进行通路分析,并使用Ch IP-PCR和q Ch IP实验对Ch IP-on-chip结果进行验证。3.采用细胞生长曲线、平板克隆实验、Ed U实验、TUNEL实验、划痕愈合实验和转移小室侵袭实验等实验技术发现,分析LSD1/SIN3A/HDAC复合体对乳腺癌细胞的存活、侵袭转移、干细胞特性获得以及对乳腺癌化疗敏感性的影响。实验结果1.SIN3A/HDAC复合体在体内与赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)存在相互作用,GST pull-down实验证实LSD1和SIN3A有直接相互作用,通过LSD1的Tower结构域和SIN3A的HID结构域共同介导的。并且LSD1/SIN3A/HDAC复合体除了有去组蛋白H3乙酰化的酶活性,还有去甲基化酶活性,可以降低H3K4的一甲基化和二甲基化水平。2.LSD1/SIN3A/HDAC复合体靶向几种细胞信号传导途径,这些途径主要涉及细胞增殖、存活、转移和细胞凋亡,特别是p53信号传导途径。我们通过实验研究发现LSD1/SIN3A/HDAC复合体作为一个整体参与基因的转录调控,协同抑制一系列靶基因,如CASP7,TGFB2,CDNK1A(p21),HIF1A,TERT和MDM2,其中一些基因是原癌基因。3.LSD1/SIN3A/HDAC复合体通过转录抑制一系列促凋亡的基因,如p21,CASP7,HIF1A和TGFB2等,抑制细胞凋亡。并且,通过直接转录抑制一系列促进EMT的基因,如TERT,CUL4A,TGFB2,MDM2,RHOA,HIF1A,以及间接抑制EMT的关键标志物,包括N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及乳腺干细胞标志物CD44等,以此来维持上皮稳态和抑制EMT诱导的肿瘤干性。慢病毒敲低LSD1会引起MCF-7细胞对化疗药物如CPT,阿霉素和紫杉醇的耐药性。实验结论赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,可以特异性催化去除组蛋白H3-K4上的单甲基化和二甲基化修饰。尽管LSD1在转录调控中可能具有广泛的作用,但最近的研究表明LSD1可能与包括Co REST/HDAC复合体,Nu RD复合体,SIRT1和PRC2在内的多种表观遗传调控复合物有相互作用,这意味着这种看似简单的酶可能存在复杂的作用机制。在这里,我们的研究指出LSD1也是SIN3A/HDAC复合体的一个组成部分。使用Ch IP-on-chip技术的分析显示LSD1/SIN3A/HDAC复合体靶向几种细胞信号传导途径,这些途径主要涉及细胞增殖、存活、转移和细胞凋亡,特别是p53信号传导途径。我们通过实验研究发现LSD1与SIN3A/HDAC复合体协同抑制一系列靶基因,如CASP7,TGFB2,CDNK1A(p21),HIF1A,TERT和MDM2,其中一些基因是致癌基因。我们的实验还发现LSD1和SIN3A对于乳腺癌细胞的存活是必需的,同时对于维持上皮细胞稳态和化疗药物敏感性也起到关键作用。我们的数据表明,LSD1是SIN3A/HDAC复合体的一个功能性亚基,为组蛋白去甲基化和去乙酰化在染色质重塑中的相互作用提供了分子基础,并且表明LSD1/SIN3A/HDAC复合体可能成为乳腺癌的新的靶标治疗策略。