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卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,近年来药物抵抗成为治疗卵巢癌的一个主要挑战。肿瘤细胞的化疗耐药与多种因素相关,包括:DNA损伤修复,化疗药物诱导的凋亡逃逸,ROS介导的氧化还原状态以及蛋白降解等。目前认为,探讨不同信号间的交互调控能更深入的阐明肿瘤耐药机制。蛋白酶体活性在肿瘤发生及化疗耐药中发挥了重要作用,且多种癌症中蛋白酶体水平异常升高。蛋白酶体能够清除氧化应激过程中受损蛋白以减轻氧化应激损伤,而抗氧化能力的增强能够促进20S及19S蛋白酶体亚基的表达。提示,蛋白酶体活性与氧化还原功能间存在着相互调控作用,探究两者间关系将更加有助于解决卵巢癌化疗耐药问题。泛素-蛋白酶体系统(UPS)通过调节参与信号转导和细胞周期途径的蛋白来维持细胞稳态。抑制蛋白酶体功能能够引起促凋亡蛋白的积累,诱导肿瘤细胞凋亡。然而,近来临床研究发现,并非所有肿瘤都对蛋白酶体抑制剂敏感。蛋白酶体抑制剂抵抗的肿瘤患者其抗氧化基因的表达水平普遍较高。其中,核因子E2相关因子2(Nrf2,基因名NEF212)介导的抗氧化应激途径作为抵抗机制在蛋白酶体抑制剂耐药表型中被发现。Nrf2能够调控蛋白酶体成熟蛋白(POMP)的转录活性,而POMP活性的增加能促进蛋白酶体抑制剂抵抗。提示,Nrf2介导的抗氧化可能与蛋白酶体介导的肿瘤耐药有关。Nrf2是抗氧化反应元件(ARE)转录复合体中的重要元素,能够调控多种保护基因的表达。药物抵抗的肿瘤细胞内,Nrf2及抗氧化相关通路基因的表达水平增高,而这种抵抗机制主要通过Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的解离,使得Nrf2入核调控抗氧化酶基因的转录。此外,糖原合成激酶(GSK3β)活性的下降也能使得Nrf2与β-转录重复包含蛋白(β-TrCP)解离,进而减少Nrf2被β-TrCP介导的蛋白酶体途径降解。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC1α,基因名PPARGC1A)同样能够协调多种抗氧化基因的表达来保护机体免于氧化应激损伤。衰老疾病模型中发现,PGC1α能够共活化Nrf2诱导抗氧化基因表达,并且研究证实两者间存在蛋白-蛋白的相互作用,但具体作用机制并不完全明晰。因此,PGC1α与Nrf2间的相互作用在抗氧化中发挥协同作用,但是否与耐药相关并不清楚。此外,线粒体氧化还原稳态的维持对于蛋白酶体活性有着重要作用。线粒体作为ROS产生的主要场所,其功能受损会导致过量的ROS产生,加重UPS负担。Nrf2能够通过上调血红素氧化酶(HO-1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)抑制线粒体ROS的产生,并且可与多种线粒体蛋白相互作用调控其蛋白稳定性和结构完整性,包括PGC1α和PGC1β。提示,Nrf2与PGC1α共同介导的线粒体功能也调控了氧化还原稳态,进而维持了蛋白酶体活性。本实验以“UPS-Anti-oxidation Axis”为切入点,探究PGC1α协同Nrf2共同调控的抗氧化及线粒体功能在维持蛋白酶体活性中的作用机制,阐明细胞耐药通路间的相互作用关系,为临床解决卵巢癌耐药提供新的思路。实验方法:1、探讨蛋白酶体抑制对A2780和SKOV3细胞顺铂敏感性的影响不同浓度蛋白酶体抑制剂Epox或100nM Epox联合不同浓度顺铂作用细胞24h后,利用MTT法检测细胞活力。2、探讨蛋白酶体抑制对A2780和SKOV3细胞Nrf2入核表达的影响100nM Epox处理细胞6h和12h,利用Western blot及免疫荧光实验检测Nrf2在核内的表达与定位;利用免疫共沉淀与免疫荧光实验检测Keap1与Nrf2蛋白的结合。3、探讨蛋白酶体抑制对A2780和SKOV3细胞氧化还原水平及凋亡的影响①100nM Epox处理细胞12h,利用RT-qPCR检测抗氧化相关基因及PGC1α基因的表达;利用DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内总ROS水平。②100nM Epox处理细胞24h,利用AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡情况;利用Western blot检测A2780和SKOV3细胞中PGC1α的蛋白表达。4、探讨SKOV3细胞中Nrf2与PGC1α间的相互调控作用①100nM Epox处理细胞12h或转染过表达Nrf2质粒,利用免疫荧光检测PGC-1α与Nrf2的核内共定位;利用双荧光素酶报告基因检测PGC1α启动子区活性,利用RT-qPCR检测Nrf2基因的表达。②PGC1α转录激动剂ZLN005处理24h或转染PGC1α-shRNA质粒后,利用Western b1ot检测Nrf2核内表达,p38及磷酸化p38、GSK3β及磷酸化GSK3β表达;利用免疫共沉淀检测Keap1与Nrf2蛋白间的结合;利用RT-qPCR检测Nrf2基因的表达。5、探讨蛋白酶体抑制或过表达Nrf2对SKOV3细胞线粒体功能的影响100nM Epox处理SKOV3细胞12h或过表达Nrf2质粒,利用JC-1、Mitotracker Red染色后流式细胞术分别检测线粒体膜电势及线粒体数量的变化;利用试剂盒检测ATP水平及细胞外耗氧率的变化;利用RT-qPCR检测线粒体基因拷贝数变化;提取线粒体蛋白,Western b1ot检测线粒体呼吸链复合体蛋白的表达。6、探讨基因沉默PGC1α联合Epox对SKOV3细胞凋亡敏感性的影响转染PGC1α-shRNA质粒后联合Epox处理细胞12h或24h,利用JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势;利用AnnexinV/PI染色流式细胞术及Western b1ot检测凋亡情况。结果:1、MTT结果表明,相对A2780细胞,SKOV3细胞对顺铂及蛋白酶体抑制剂Epox敏感性差;并且Epox能够明显增强A2780细胞顺铂敏感性,但在SKOV3细胞中不明显。2、免疫荧光及免疫共沉淀实验表明,Epox能够通过降低Keap1与Nrf2间的结合增强Nrf2入核表达。3、评价细胞氧化还原水平发现,Epox明显降低A2780细胞抗氧化基因及PGC1α基因的表达,增加ROS生成且促进凋亡,而SKOV3细胞改变不明显。A2780细胞的PGC1α表达明显低于SKOV3细胞。4、PGC1α和Nrf2间相互调控作用检测发现,Epox增强PGC1α和Nrf2在SKOV3细胞核内的共定位,并且Epox或过表达Nrf2能够增强PGC1α的启动子区活性。ZLN005转录激活PGC1α能够增强Nrf2的核内表达,降低Keap1与Nrf2的结合,增强p38和GSK3β蛋白的磷酸化并且增强Nrf2基因表达,而转染PGC1α-shRNA质粒后结果相反。5、线粒体功能相关指标检测发现,Epox或过表达Nrf2能够增强SKOV3细胞的线粒体膜电势、使线粒体数量增加、ATP水平增加、线粒体拷贝数增多并且使SKOV3细胞耗氧量(OCR)增加、线粒体呼吸链蛋白表达增加。6、凋亡实验结果显示,通过转染PGC1α-shRNA质粒抑制PGC1α能够降低SKOV3细胞线粒体膜电势,增加凋亡率及凋亡相关蛋白表达;联合Epox后,以上现象进一步加重。实验结论:1.蛋白酶体抑制剂Epox不能增加SKOV3细胞顺铂敏感性,提示SKOV3细胞可能存在包括蛋白酶体抑制剂在内的多药耐药。2.利用Epox诱导Nrf2入核,促使SKOV3细胞抗氧化水平及PGC1α表达增加,提示Nrf2/PGC1 α通路可能参与了蛋白酶体抑制诱导的抗氧化信号通路的调控。3.利用Epox或过表达Nrf2均能增强SKOV3细胞的线粒体功能,而抑制PGC1α能够增加SKOV3细胞Epox 诱导的凋亡敏感性。提示Nrf2/PGC1α通路也可以通过调控线粒体功能维持细胞氧化还原稳态,进而参与SKOV3细胞的耐药调控。