大珠母贝金属硫蛋白cDNA序列克隆与表达研究

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大珠母贝(Pinctada maxima)是生产海水大型优质珍珠最理想的育珠贝。自1985年以来,大珠母贝苗种养殖过程中出现大量死亡现象,特别是5cm左右的幼贝很难在海区养成;同时,由于人工滥捕,大珠母贝野生资源日渐稀少,已濒临绝种的危险,大珠母贝养殖业出现了前所未有的困境,严重影响着我国珍珠产业的发展。然而大珠母贝死亡的原因尚不清楚,而水体的污染可能是因素之一。因此,开展污染因子对大珠母贝幼贝的影响研究,对探讨大珠母贝的死亡原因、改良种质,实现大珠母贝养殖业健康、可持续发展具有重要意义。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。金属硫蛋白在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究从大珠母贝cDNA文库中分离、克隆得到大珠母贝金属硫蛋白基因(PMMT),开展了原核表达研究,并研究了镉离子的急性毒性表达规律,以阐明金属硫蛋白的作用机理和激活途径,探讨它在大珠母贝应激反应和免疫防御保护过程中的作用,为研究大珠母贝的免疫防御体系,培育抗病抗逆的大珠母贝优质品种奠定基础。1.从大珠母贝外套膜cDNA文库中克隆获得了大珠母贝金属硫蛋白的全长cDNA序列,长599bp,5’非翻译区(untranslated region,UTR)为75bp,3’UTR为296bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为228bp,编码75个氨基酸。其中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸。2.氨基酸序列特征分析发现,大珠母贝金属硫蛋白富含Cys-X(1-3)-Cys结构,其中含有9个Cys-X-Cys结构:CRC,CAC,CCC,CQC,CKC,CAC,CGC,CNC,CSC;2个Cys-X-X-Cys结构:CPNC,CTDC;4个Cys-X-X-X-Cys结构:CTDAC,CGDNC,CKVKC,CGVGC;同时还有个2个Cys-Cys结构。大珠母贝金属硫蛋白的CCCXXXCXCX(X为除半胱氨酸以外的其他氨基酸)与无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列(CKCXXXCXCX)极为相似,只相差1个氨基酸。大珠母贝金属硫蛋白末端保守序列为CgCgvgCTTlsdCnCt-dCsCK,与软体动物的金属硫蛋白末端保守序列CxCxxxCTGxxxCxCxxxCxCK基本相似,只是CTT代替了CTG。该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员。根据1999年Binz金属硫蛋白分类方法可将该金属硫蛋白归为Fmaiy 2:mollusc MTs,subfamily mo:other molluscMTs。大珠母贝金属硫蛋白基因的克隆为深入研究金属硫蛋白家族的进化以及海洋贝类金属硫蛋白的多样性,理解其结构与功能的关系奠定了基础。3.构建了金属硫蛋白的原核表达载体pET-32a-PMMT,经IPTG诱导,实现了大珠母贝金属硫蛋白在大肠杆菌中的表达,为进一步开展生物活性和功能研究奠定了基础。4.根据所获得的cDNA序列设计一对RT-PCR引物,用半定量RT-PCR的方法在转录水平上检测了大珠母贝幼贝在不同浓度镉离子刺激下金属硫蛋白基因的表达情况。在未受镉离子刺激的空白组可检测到金属硫蛋白基因的表达。在低浓度镉离子刺激下(0.005mg/mL),大珠母贝金属硫蛋白表达量有所增加,为空白组1.70倍,至中高浓度组(0.05mg/L、0.1mg/mL),这一比值分别增加到了1.79和2.08倍,说明镉离子能够诱导大珠母贝金属硫蛋白基因的表达,表达水平随镉离子浓度增加而上升,具有作为指示养殖环境中镉离子污染水平的生物标志物的作用,为研究重金属污染对大珠母贝的影响提供了参考资料。
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