研究背景:血源性的髓系细胞在很多重要生物学过程包括组织愈合、免疫防御及损伤修复中作用突出。其完整的功能须依赖于大量存在于血循环和特异器官/组织内的成熟髓系细胞,如中枢神经系统、脾、肺、肝和皮肤。髓系细胞在脊椎动物中主要有两类,分别是粒细胞（嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,中性粒细胞,肥大细胞）和单核/巨噬细胞（血液巨噬细胞,组织定居巨噬细胞,树突状细胞）,这两类细胞的形态及生物学功能都具有各自特征。粒细胞和单核/巨噬细胞最早产生于原始造血阶段,在该阶段只产生有限数量的红细胞和髓系细胞。在这之后的永久造血阶段,髓系细胞可以由造血干细胞通过“髓系形成”的分化过程发育成熟。“髓系形成”是指中胚层细胞特化成为髓系祖细胞或造血干细胞以及巨噬细胞和中性粒细胞命运决定的过程。这是一个复杂而有序的动态过程,转录因子在其中起了决定性的调控作用。这些调控因子的突变或基因重排会导致造血干细胞或前体细胞的单克隆扩增,继而引发急性/慢性淋巴细胞白血病（ALL/CLL）或急性/慢性髓系细胞白血病（AML/CML）。髓系白血病起源于血液干细胞或前体细胞的恶性克隆性疾病,异常的白血病细胞因分化障碍、增殖失控和凋亡受阻而使细胞发育停滞在不同阶段,抑制正常造血。其中,造血过程中的关键转录因子的突变可能在白血病的发生中起着至关重要的作用,包括MLL、AML1相关的基因融合,P53基因的功能缺失,nm23基因表达下调,BCL-2基因高表达等。随着医学的发展,尽管在过去数十年对髓系发育以及疾病模型建立有大量的研究成果,但对造血发育的研究主要都是在小鼠上进行的,而检测小鼠胚胎时期的髓系细胞是非常困难的,使得早期造血的基因网络远未明确。与此同时,虽然小鼠动物模型一直是备受重视的一种药物筛选模型。其可以从整体上直观的反映出药物不良反应及毒副作用,所获得的结果也具有十分重要的临床价值和应用前景。但小鼠的动物模型存在成本高、周期长、所需样品量大等明显的不足之处。因此,若利用其他脊椎动物模型来进行研究可弥补我们现有知识的缺陷,达到深入了解发病机制并最终攻克白血病的目的。斑马鱼是近十几年内被广泛用于胚胎发育、疾病研究、药物筛选的脊椎动物模型。它在二十世纪三十年代开始用于环境评价,1988年首次用于新药评估。在欧美,斑马鱼环境评估和药物研发已经得到了政府监管部门GLP（Good Laboratory Practice）认证。斑马鱼以其体外受精、体积小、生殖力强、身体透明等诸多优势,迅速地应用到药物筛选、人类疾病研究、发育生物学研究、环境安全和免疫学研究各个研究领域中。斑马鱼和人的血液组成以及基因调控机制的相似使得斑马鱼成为研究造血发育的理想动物模型。斑马鱼的造血主要发生在肾间质。在胚胎的晚期与人骨髓一致,肾脏可以产生不同谱系的血细胞,这些血细胞在肝脏和胸腺成熟后进入血液循环。这个过程涉及到血细胞的发育、分化和成熟。而参与这个过程中的调控因子与人类高度保守。更重要的是,一些研究显示,这些调控因子的突变或基因重排会导致造血干细胞或前体细胞的单克隆扩增,继而引发急性/慢性淋巴细胞白血病（ALL/CLL）或急性/慢性髓系细胞白血病（AML/CML）。而斑马鱼已经作为疾病模式动物用于阐述一些造血疾病的新的分子机制和筛选新的药物。利用斑马鱼白血病模型不仅可以进一步研究人白血病发病的分子机制,也可以进行在体新的小分子化合物的药筛。虽然部分与人类白血病相对应的转基因斑马鱼或者突变体斑马鱼模型已经建立,并且已经投入到药物筛选的过程中。但是还有很大一部分的白血病类型尚缺乏斑马鱼疾病模型,例如c-myb、pu.1、BCR-ABL、TET2 等等。pu.1是从spil的基因产物中分离的,后者则是从SFFV（spleen focus forming virus）诱导的鼠白血病中分离出来的原癌基因。Pu.1是Ets转录因子家族中的一员,其DNA结合区为螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）结构,能识别一个富含嘌呤GGAA/T（PU box）基序的核心DNA元件并与之结合,故名PU.1。转录因子PU.1在早期髓系祖细胞产生过程中必不可少,是决定髓系向单核细胞还是向粒细胞分化的重要因子。Pu.1不但影响早期髓系造血过程,据报道它还参与人与小鼠的白血病生成过程。在人类急性髓细胞白血病病人中Pu.1基因的表达水平下调,对126个急性髓细胞白血病病人的调查中发现有7%的病人Pu.1基因发生突变。同样的降低Pu.1的活力可以高效诱导小鼠AML。这些研究结果表明Pu.1不仅是髓细胞生成过程中关键的调控者,而且是髓细胞白血病的抑癌基因。基于斑马鱼自身的优势,本研究中,我们应用TILLING（Targeted Induced Local Lesions In Genomes）获得了斑马鱼Pu.1表达减少型突变体,并在此基础上,分别观察其胚胎期和成鱼期造血表型的变化,初步了解pu.1基因突变对斑马鱼晚期造血的影响。并进一步根据突变体斑马鱼表型变化情况,选择具有针对性的药物进行处理,观察药物对pu.1突变体异常造血的纠正情况,以期为进一步的高通量药物筛选做铺垫。c-MYB作为一种重要的转录因子,同时也是一种原癌基因,最早是从鸟类成髓细胞增生症病毒（AMV）分离出来的与v-MYB同源的原癌基因。由3个主要的功能区构成:（1）位于N-末端的DNA结合区,能与DNA序列发生特异性结合;（2）位于c-myb中央的转录激活区;（3）位于C-末端的负性调控区,含亮氨酸拉链结构,可抑制转录激活功能。c-myb特异性表达在造血干细胞以及祖细胞中,并且随着细胞分化而降低。c-myb敲除小鼠以及突变体斑马鱼的研究显示了 在造血各个阶段都有作用,如造血干细胞,红系,髓系以及淋系。c-Myb在早期造血中的作用提示如果c-myb调节异常会导致一些血液病,例如白血病。而c-myb的异常激活和异位表达则会导致白血病细胞的转化。在禽类和鼠中,由于病毒插入而引起的缩短型的c-Myb通常会导致c-Myb的异常激活,从而引起白血病转化。在小鼠中抑制c-Myb的活性可以抑制AML。临床上,在AML,ALL以及CML病人的白血病细胞中都发现了 C-MYB的高表达。近期的研究在一些淋巴白血病以及髓系白血病中发现C-MYB的一些基因损伤,如染色体异位、基因组复制、结构异常。总而言之,C-MYB在白血病发生中起到了关键的作用。然而,在动物模型中,C-MYB直接导致白血病发生的证据依然缺乏。而缺乏可存活的C-MYB激活的动物模型也导致追踪和C-MYB相关血液疾病病程的困难。在这篇研究中,我们介绍一种会导致淋系和髓系白血病的c-myb异常激活的转基因斑马鱼系。并分别解析该斑马鱼从胚胎到成鱼的血液表型。并根据表型选取临床的一些抗肿瘤药物进行已知临床药物的验证。以期该模型能为进一步研究c-myb在白血病发病机制中的作用以及开发新的抗肿瘤药物提供一个有价值的平台。本论文分为两个部分,第一部分分为两个章节,第二部分分为三个章节:第一部分为pu.1缺陷斑马鱼髄系白血病模型的建立。第一部分第一章为pu.1缺陷斑马鱼胚胎以及成鱼时期的血液表型;第一部分第二章为化疗药物对幼鱼期pu.1缺陷突变体异常造血的影响;我们的研究表明在pu.1突变体中,3dpf或者更早,不成熟的髓系细胞在CHT组织中就增多。该突变体在从幼鱼到成鱼的过程中,肾脏血和外周血中也表现出明显的髓系增多。这种造血紊乱和人类髓系前期白血病和白血病表型相似,并且化学治疗对pu.1突变体的白血病症状有效,因此,pu.1斑马鱼可以作为体内大规模抗癌药物筛选的模型。第二部分为c-myb异常激活斑马鱼髓系白血病模型的建立。第二部分第一章为c-myb异常激活斑马鱼系的鉴定;第二部分第二章为c-myb异常激活斑马鱼的血液表型鉴定以及机制研究;第二部分第三章为已知治疗药物对斑马鱼疾病模型的药理学验证。我们发现,c-myb异常激活转基因斑马鱼c-myb-gfp。在该斑马鱼中产生了 2种不同的c-myb转录本。c-myb-gfp斑马鱼从胚胎到成鱼都会出现粒细胞异常增殖的表型。并且部分鱼会随着年龄进展为AML和ALL。这些表型和人类的MDS以及AML,ALL表型类似。这些表型可以被临床的一些抗肿瘤药物拯救。该模型为进一步研究c-myb在白血病发病机制中的作用以及开发新的抗肿瘤药物提供了一个非常有价值的平台。第一部分pu.1缺陷斑马鱼髓系白血病模型的建立第一章pu.1缺陷斑马鱼胚胎以及成鱼时期的血液表型1.目的1)初步确定pu.1突变体胚胎以及成鱼的血液表型。2)阐明pu.1突变体髓系缺陷的细胞学基础。3)建立并鉴定一个新的斑马鱼白血病动物模型。2.方法1)应用WISH来检测特异性表达于髓系细胞的基因lyz、mpo和cebpl在幼鱼3dpf和5dpf这两个时期的表达情况,以间接提示胚胎期突变体中髓系造血祖细胞变化情况。并应用苏丹黑（Sudan black）染色法检测相应各时期成熟粒细胞变化情况。同时利用髓过氧化物酶活性染色检测中性粒细胞的功能。2)采用BrdU标记和TUNEL实验,来确定在突变体中髓系祖细胞在分化过程中是否有增殖和凋亡的变化。3)根据细胞和形态学特征,观察并鉴别成鱼髓系祖细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。巨噬细胞内含有吞噬的物质,如凋亡细胞碎片,而中性粒细胞有分叶核及活跃的运动颗粒。斑马鱼髓系祖细胞没有以上的特征,但却有能与红细胞清楚地区别开来的髓系特征。3.结果1)与野生型斑马鱼相比,幼鱼在3dpf时期Pu.1功能缺陷型纯合突变体PBI区域中无论是髓系祖细胞标志物cebpl、cebpα还是lyz、mpo均明显增加,而巨噬细胞的标志物mfαp4明显减少,与此相一致,突变体PBI区域中苏丹黑（SB）染色阳性细胞在3dpf时期也明显增加。同时髓过氧化物酶的活性显示pu.1突变后,中性粒细胞中的髓过氧化物酶活性下降,提示中性粒细胞功能受影响。2)我们利用TUNEL技术检测中性粒细胞的凋亡,结果显示pu.1突变体中性粒细胞的凋亡与野生型无明显差别。然后利用BrdU技术检测中性粒细胞的增殖状态,结果显示pu.1突变体中性粒细胞的增殖增加。3)通过人工血细胞计数发现,18个月pu.1突变体肾脏血中的髓系细胞增加了 23%,淋系细胞减少了 20%。细胞学分析显示pu.1突变体的肾脏血中累积的髓系细胞大多数都是未成熟的髓系细胞。此外,在突变体外周血中不成熟的髓系细胞数量也有累积。4.结论1)突变体CHT区粒细胞明显扩增,与此同时巨噬细胞数目降低。pu.1突变体中过氧化物酶活力显著降低,说明扩增的中性粒细胞是不成熟的。2)突变体中富集的髓系细胞是由于中性粒细胞的增至多而不是因为凋亡减少导致的。3)突变体具有和人类MDS和AML的类似的血液表型:肾脏血中不成熟的髓系细胞的增多和外周血中髓系细胞的聚集。第二章化疗药物对幼鱼期Pu.1缺陷突变体异常造血的影响1.目的基于pu.1突变体造血表型的变化,我们选择阿糖胞苷及柔红霉素（分别为细胞周期特异性及细胞周期非特异性化疗药）这两种常用抗白血病临床药物,作用于早期斑马鱼幼鱼,观察这些已知临床药物对该斑马鱼疾病模型的作用。2.方法1dpf的pu.1G242D突变体和其同胞的胚胎放入浓度为103 mg/L的阿糖胞苷或者30 mg/L的柔红霉素培养液中孵育4天,然后将得到的5dpf（因为这个时间点pu.1突变体中富集的粒细胞可以明显而容易的计数）的幼鱼进行苏丹黑（SB）染色,通过计算SB+的细胞数量来确定粒细胞的数量。3.结果结果显示,经过阿糖胞苷处理四天后pu.1G242D突变体胚胎中SB+细胞的数量明显比未经处理的pu.1G242D突变体少的多,与此同时野生型对照组和野生型处理组之间没有明显变化。有意思的是,柔红霉素处理似乎对pu.1G242D突变体中SB+粒细胞数量的影响很小。这种结果显示,阿糖胞苷而非柔红霉素可以缓解pu.1G242D突变体中髓系细胞的增殖,减轻其白血病症状。4.结论:这种造血紊乱和人类髓系前期白血病和白血病表型相似,并且化学治疗对pu.1G242D突变体的白血病症状有效,因此,pu.1G242D斑马鱼可以作为体内大规模抗癌药物筛选的模型。第二部分c-myb异常激活斑马鱼髓系白血病模型的建立。第一章c-myb异常激活斑马鱼系的鉴定1.目的1)从RNA以及蛋白水平鉴定c-myb异常激活的表型。2)阐明c-myb异常激活的原因。2.方法1)我们将c-myb-gfp转基因斑马鱼中PAC的GFP附近的区域进行测序。2)对2dpf的c-myb-gfp/c-mybhk=3/hk=3胚胎进行了3’以及5’RACE实验。3)我们对c-myb-gfp转基因斑马鱼的整体胚胎以及成鱼的肾脏进行了 WISH和qPCR实验。3.结果1)我们测序发现在翻译起始位点之前出现了一段485bp的重复序列,它包括了 315bp的核心启动子区域以及170bp的5’ UTR。而这段485bp的重复区域作为一个小启动子可能重新启动了 基因的表达。2)我们进一步测这个小启动子的下游序列,发现下游的c-myb基因并不完整,只到内含子10。而接着内含子10的序列分别是77bp的未知序列,氨苄青霉素抗性基因,pWSMK-T载体上的一段序列,315bp c-myb基因的核心启动子区域以及外显子1到外显子15的完整c-myb基因。3)RACE实验发现除了原有的c-mybh=3转录本,另外发现了由c-myb-gfp中PAC产生的2种转录本（分别命名为c-myb-WT,c-myb-T1）。通过将RACE产物测序结果与野生型序列对比,发现其中由第二个小启动子启动的c-myb-WT转录本与野生型斑马鱼的c-myb基因转录本完全一致。4.3kb的c-myb-T1则由截断的c-myb外显子1到外显子10以及一个接近完整c-myb基因（外显子2到外显子15）组成。c-myb-T1翻译的蛋白是由两段蛋白融合而成的,第一段是缺少完整C端的负性调控区域的c-Myb蛋白,另一段则是在N端少了 8个氨基端的c-Myb蛋白。4)WISH和qPCR实验表明在c-myb-gfp转基因斑马鱼中,c-myb基因正确的表达在HSC产生的部位-主动脉性腺中肾区（AGM）,尾部造血组织（CHT）以及肾脏中,但是,c-myb基因的表达却增强了很多。4.结论:1)测序结果提示我们下游中的从氨苄青霉素抗性基因到外显子10的序列可能是c-myb-gfp转基因斑马鱼PAC中的又一段重复序列。并且通过预测发现485bp的小启动子可以启动下游c-myb基因的表达。2)c-myb-gfp转基因斑马鱼产生3种不同c-myb的转录本。3)c-myb基因在c-myb-gfp转基因斑马鱼中异常激活。第二章c-myb异常激活斑马鱼的血液表型鉴定以及机制研究1.目的1)初步确定c-myb突变体胚胎以及成鱼的血液表型。2)阐明c-myb突变体髓系缺陷的细胞学基础。3)白血病模型与临床结果的系统比较及分型。4)初步阐明c-myb突变体髓系缺陷的分子学机理。2.方法1)在胚胎时期,利用标记不同阶段髓系细胞的探针进行WISH实验来检测详细的髓系造血改变,如用lcp标记早期髓系细胞;c/ebpα,c/ebpl标记不成熟的中性粒细胞:mpo,lyz标记成熟的中性粒细胞;mfαp4来标记成熟的巨噬细胞。以期阐述c-myb在斑马鱼中特异性髓系祖细胞分化以及随后中性粒细胞和巨噬细胞命运选择中的作用。2)在成鱼时期,我们将c-myb过表达斑马鱼的肾脏、血液循环系统中髓系细胞的数量、亚型、分化阶段的情况用流式细胞仪（FACS）和细胞学方法分析。3)用Brdu、PH3抗体染色、TUNEL实验确定髓系细胞分化过程中增殖和凋亡的改变。4)我们可以从整体表型、外周血/肾脏血计数、造血组织病理、疾病进程和分子调控等多个层面与临床上的临床病例表现、外周血/骨髓血常规、临床进展等结果进行比对。将该c-myb过表达斑马鱼与粒系转基因斑马鱼Tg（lyz:dsRed）以及淋系转基因斑马鱼Tg（rαg2:dsRed）杂交获得双转基因斑马鱼。统计MDS模型在自然病程下进入急变期的比率。并根据细胞形态,组织切片来区分急变期细胞的类型,统计MDS分别发展为AML和ALL的比率。3.结果1)WISH结果显示表达巨噬细胞特异性标记物mfαp4的细胞在3dpf的c-myb过表达中数量显著减少。相反的,表达粒细胞特异性标记物lyz,mpo等细胞在3dpf的c-myb过表达斑马鱼中数量显著增多。2)对从3个月和1年的c-myb过表达斑马鱼和同胞对照组中分离的外周血（PB）和肾脏血（KM）细胞进行不同细胞类型计数分析发现,在3个月和1年的c-myb过表达斑马鱼中PB血的组成比例与同胞对照组没有明显区别。然而KM中髓系细胞与同胞对照组相比,在3个月的c-myb过表达斑马鱼中数量明显增多,同时伴随祖细胞的减少。到了1年的时候,KM中髓系细胞数量与同胞对照组相比增加了一倍,并伴随其它谱系细胞的减少,这些表型与髓系异常增生相符合。流式细胞分析结果与之前的一致,显示在1年的c-myb过表达斑马鱼中髓系细胞数量增多两倍并伴随其它谱系细胞的减少。并且通过流式细胞分析可以看出髓细胞不仅数量增多,其大小变大,粒性更强。3)BrdU实验结果显示c-myb过表达斑马鱼胚胎以及成鱼肾脏中髓系细胞的增殖细胞显著增多。4)1年的c-myb过表达斑马鱼肾脏出现肿大,与同胞对照组相比,肾脏的面积增加1.37倍,重量增加了 4倍。肝脏也变重并且有大量的SB阳性细胞浸润与对照组相比。从3个月起,一些肿瘤样和急性白血病样表型会出现在c-myb过表达斑马鱼中,如恶液质,眼肿,骨弯曲,腹部肿块,出血等。并且部分c-myb过表达斑马鱼会随着时间进展为AML以及ALL。5)在c-myb过表达斑马鱼中,促进细胞周期的基因表达增多,抑制细胞周期的基因表达减少。4.结论:1)早期胚胎时期c-myb基因异常激活导致异常的粒细胞累积。2)过表达斑马鱼成鱼出现MDS样表型。3)过表达斑马鱼中粒细胞增多主要由于增殖增多导致。4)过表达斑马鱼可以从MDS进展为AML以及ALL。第三章已知治疗药物对斑马鱼疾病模型的药理学验证1.目的斑马鱼是进行药物研发的理想模式动物。因此我们观察了临床常用抗白血病药物在c-myb过表达斑马鱼中的效果。阿糖胞苷是治疗AML的常用化疗药物,它是通过阻断细胞周期而起作用。同时观察了 过表达斑马鱼中异常增殖的髓系细胞对c-myb靶向药物CDK9抑制剂弗拉平度的反应。2.方法将1dpf的c-myb过表达斑马鱼胚胎以及同胞对照用103 mg/L阿糖胞苷孵育,在6dpf的时候对胚胎CHT区域的进行SB阳性粒细胞计数。同时将1dpf的c-myb过表达斑马鱼胚胎以及同胞对照用0.5um的弗拉平度孵育,在7dpf的时候对胚胎CHT区域的进行SB阳性粒细胞计数。3.结果在经过5天的阿糖胞苷处理后SB阳性粒细胞数量与未经过药物处理组相比显著减少。弗拉平度可以显著减少c-myb过表达斑马鱼中SB阳性粒细胞的数量,而对同胞对照组没有影响。同时,弗拉平度可以显著减少c-mybhyper中SB阳性粒细胞的数量,而对同胞对照组没有影响。与未经药物处理的c-myb过表达斑马鱼相比,经过弗拉平度处理的c-myb过表达斑马鱼中c-myb的RNA表达水平显著降低。4.结论:1)异常激活诱导的髓系异常增殖表型可以被细胞周期特异性抗增殖药物阿糖胞苷缓解。2)临床上的c-myb靶向药可以减少c-myb过表达斑马鱼中的髓系细胞异常扩增。