目的:糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）是糖尿病较为常见且严重的慢性并发症,典型的病理变化包括轴突变性、轴突缺失、髓鞘异常和节段性脱髓鞘。雪旺氏细胞作为外周神经主要的胶质细胞,为维持正常轴突冲动传导和促使受损轴突的再生提供营养支持。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和神经营养因子3（Neurotrophin 3）属于雪旺氏细胞分泌的蛋白多肽类神经生长因子,它们是神经细胞及神经胶质细胞生存、增殖、迁移和分化过程中所必需的营养物质。雪旺氏细胞中BDNF和Neurotrophin 3缺乏在糖尿病周围神经病变的发病机制中起重要作用,然而对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF和Neurotrophin 3表达下调的机制尚未完全阐明。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学修饰方式,在调节基因转录、染色质重塑、基因组修饰和基因组完整性方面起着关键作用。DNA甲基化通常发生在基因启动子DNA的Cp G二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子上,这一过程主要受DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）和去甲基化酶（ten-eleven translocation,TET）的调节。DNA甲基化是否参与糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF表达缺陷,目前尚不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种参与调节细胞多种功能的信号转导途径,可以调节细胞的增殖、代谢、自噬和凋亡,是由丝氨酸和苏氨酸组成的多蛋白激酶复合物。多种刺激,包括生长因子、葡萄糖和氨基酸等营养物质,都会影响mTOR信号通路。在mTOR信号通路上游,有不同途径对其调控,包括蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB或Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）,以使细胞对不同的刺激产生反应。但是,糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF、Neurotrophin 3的表达与DNA甲基化和mTOR信号通路及其上游调控分子之间是否存在网络交互关系,目前尚未见相关报道。因此,本研究通过建立糖尿病小鼠模型和利用体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96,首先,从组织水平观察糖尿病小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3的表达情况及髓鞘结构变化;然后,从细胞水平观察体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96中BDNF及Neurotrophin 3在m RNA及蛋白水平的表达变化,进一步检测BDNF启动子DNA的甲基化状态及DNA甲基转移酶DNMT的表达变化情况;同时应用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）和特异性DNMT1 sh RNA质粒进行干预,观察DNMT1和BDNF的表达变化情况;最后,检测mTOR信号通路及其上游Akt、AMPK通路对高糖诱导的RSC96细胞中DNMT1和BDNF表达的影响。从而系统探究了DNA甲基化以及Akt/mTOR信号通路对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响,为糖尿病周围神经病变的预防和治疗提供新的研究思路,探索新的治疗干预靶点。方法:1. BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化将CD1雄性小鼠随机分为两组:正常组（normal mice）和糖尿病组（diabetic mice）。糖尿病小鼠模型构建采用腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,溶于0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,p H 4.4,150 mg/kg）,正常组小鼠只注射相等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,72 h后尾尖取血测定血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L者定义为糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠成模后,每周检测血糖,不符合标准者弃去,喂养16周,处死小鼠,分离坐骨神经,固定于4%多聚甲醛或4%戊二醛,用于免疫组织化学、神经髓鞘固蓝染色及电镜技术检测;部分坐骨神经组织用于提取蛋白。免疫组织化学和Western blot检测坐骨神经BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达。神经髓鞘固蓝染色及电镜技术观察小鼠坐骨神经髓鞘结构变化。2.体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测大鼠雪旺氏细胞系RSC96在37℃,5%CO₂培养箱内,用添加有10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基中培养。（1）检测高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达变化:将RSC96细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose,normal glucose,N）、高糖组（25mmol/L glucose,high glucose,H）和甘露醇高渗对照组（5.5 mmol/L glucose+19.5 mmol/L mannitol,M）。实验前细胞在无血清培养基中培养,以使其同步化。给予相应刺激1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF、Neurotrophin 3蛋白表达,Real-time PCR检测BDNF m RNA表达。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:无血清培养基同步化细胞后,用DNA甲基转移酶抑制剂（10μmol/L 5-Aza）或组蛋白去乙酰酶抑制剂（400 nmol/L TSA）处理RSC96细胞,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）、高糖+400 nmol/L TSA组（H+TSA）。培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF蛋白表达。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:无血清培养基同步化细胞后,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）和高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）组,细胞培养3 d后,基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）进行RSC96细胞基因组DNA提取,提取的DNA经亚硫酸盐修饰、纯化、回收备用。通过网站设计BDNF启动子区甲基化和非甲基化序列的引物对,甲基化及非甲基化引物进行PCR扩增、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,计算甲基化的脱氧核糖核酸/甲基化+未甲基化脱氧核糖核酸,用于表示甲基化程度。3.DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:将RSC96细胞分为正常糖组（N）和高糖组（H）,3 d后提取细胞总RNA,经过纯化、水解得到m RNA片段,经逆转录酶催化和随机引物合成第一条c DNA链,然后在DNA聚合酶I作用下合成第二条c DNA链,这些c DNA片段经过末端修复和连接,形成最终的c DNA文库,利用Illumina Hi Seq2500进行测序。（2）检测高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,实验前经无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。高糖刺激细胞1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测DNMT1蛋白表达。（3）抑制DNMT1对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:实验前用无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。将RSC96细胞分为正常糖组（N）、正常糖+10μmol/L 5-Aza组（N+5-Aza）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）。3 d后收集细胞,Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:构建DNMT1基因特异性sh RNA质粒并命名为p Genesil-1-DNMT1,高糖刺激的RSC96细胞随机分为未转染组（untransfection）、阴性对照组（p Genesil-1）和p Genesil-1-DNMT1转染组（p Genesil-1-DNMT1）。转染48 h后Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。4.Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）蛋白表达。（2）检测mTOR通路抑制剂Torin1及激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞D NMT1及BDNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+500 nmol/L Torin1组（N+Torin1）;正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μm ol/L MHY1485组（H+MHY1485）,培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光检测DNMT1蛋白表达,Western blot检测S6K、phospho-S6K（Thr 389）、D NMT1及BDNF蛋白表达。（3）检测高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测Akt、phosph o-Akt（Ser 473）、phospho-Akt（Thr 308）、AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达。（4）检测Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorp hin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和B DNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+DMSO组（N+DMSO）、正常糖+LY294002/Dorsomorphin组（N+LY294002/Dorsomorphi n）,高糖组（H）、高糖+DMSO组（H+DMSO）、高糖+LY294002/Dorsomorp hin组（H+LY294002/Dorsomorphin）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和BDNF蛋白表达。结果:1.BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化。（1）Western blot检测结果显示:与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经组织中Pro-BDNF和mature-BDNF及Neurotrophin 3蛋白表达分别下降74.4%、40.1%和59.0%（P<0.05）。（2）免疫组化结果显示:小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3蛋白主要定位于细胞胞浆和胞核,呈棕黄色颗粒状分布,与正常组相比,糖尿病组二者表达减弱,分别降低72.8%、36.6%（P<0.05）。（3）神经髓鞘固蓝染色结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘变薄。（4）电子显微镜结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘结构不规则,出现内折现象。2. 体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测。（1）高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophins 3蛋白表达变化:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,BDNF表达在高糖刺激2 d开始下降,且高糖刺激RSC96细胞2 d和3 d,Pro-BDNF蛋白表达分别下降了46.5%和48.3%（P<0.05）,同样,mature-BDNF蛋白表达分别下降了32.1%和23.7%（P<0.05）;但高糖刺激RSC96细胞1 d,与正常糖组和甘露醇高渗对照组相比,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达无明显差异（P>0.05）。而各组Neurotrophin 3蛋白在不同时间点的表达均没有明显差异。细胞免疫荧光结果显示:BDNF和Neurotrophin 3蛋白均定位于RSC96细胞胞核及胞浆,与正常糖组及甘露醇高渗对照组相比,高糖刺激导致RSC96细胞BDNF蛋白绿色荧光表达降低,但Neurotrophin 3蛋白表达无明显变化。Real-time PCR结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞中BDNF m RNA下降了61.4%（P<0.05）。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:Western blot结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组RSC96细胞中BDNF蛋白表达升高,Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是高糖组表达量的1.23倍和1.26倍（P<0.05）。然而,H+TSA组与高糖组比较,BDNF蛋白表达未见升高。细胞免疫荧光结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组细胞BDNF呈强阳性表达,而H+TSA组细胞BDNF表达未见明显改变。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:与正常糖组细胞相比,高糖组RSC96细胞BDNF外显子I和外显子II启动子的甲基化程度显著增加（P<0.05）,H+5-Aza组外显子I和II的启动子甲基化程度降低（P<0.05）。相比之下,正常糖组和高糖组外显子IV（完全非甲基化）和外显子IX（几乎完全甲基化）启动子的甲基化程度没有差异（P>0.05）。3. DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:RNA测序结果提示高糖组RSC96细胞DNMT1和DNMT3a m RNA表达水平升高,尤其是DNMT1m RNA表达水平显著升高。而正常糖组（N）和高糖组（H）细胞DNMT3b、TET1、TET2和TET3 m RNA的表达没有明显差别。（2）高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:Western blot检测结果显示:高糖刺激RSC96细胞1 d、2 d、3 d,高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量分别是正常糖组的2.13倍、2.22倍和2.44倍（P<0.05）。正常糖组和甘露醇高渗对照组DNMT1蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。细胞免疫荧光检测发现DNMT1主要定位于RSC96细胞的细胞核,高糖刺激3 d后并没有改变DNMT1的亚细胞定位;但与正常糖组相比,高糖组DNMT1蛋白绿色荧光的表达水平显著增加。（3）5-Aza抑制对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:5-Aza使正常糖组细胞DNMT1蛋白表达量下降了55.9%（P<0.05）,使高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量下降了59.3%（P<0.05）。H+5-Aza组RSC96细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是单纯高糖组的1.67倍（P<0.05）和1.35倍（P>0.05）。而5-Aza对正常糖组细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量无明显影响。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:与阴性对照组（p Genesil-1）相比,p Genesil-1-DNMT1组RSC96细胞中DNMT1蛋白表达量下降了70.5%（P<0.05）;Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量比阴性对照组（p Genesil-1）分别明显增加了29.3%和82.9%（P<0.05）。4. Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞phospho-mTOR（Ser2448）降低了45.3%（P<0.05）。正常糖组及甘露醇髙渗对照组细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达无差异（P>0.05）。（2）mTOR通路抑制剂Torin1和激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:Torin 1显著抑制正常糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达量明显降低（P<0.05）,同时使DNMT1表达量增加了1.04倍（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量分别降低了37.8%（P<0.05）和29.3%（P>0.05）。细胞免疫荧光结果显示:与正常糖组相比,Torin 1组增加了RSC96细胞核内DNMT1的表达,表现为强烈的绿色荧光;MHY1485能促进高糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达水平明显增加（P<0.05）,同时使DNMT1蛋白表达量降低49.9%（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量明显增加（P<0.05）。（3）高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组及甘露醇髙渗对照组相比,高糖组phospho-Akt（Ser 473）和phospho-Akt（Thr 308）蛋白表达量分别降低了74.1%和80.6%（P<0.05）,phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达量升高了46.5%（P<0.05）,三组之间总Akt和AMPK蛋白表达量无明显差异。（4）Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorphin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:LY294002使正常糖及高糖培养的RSC96细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显降低（P<0.05）,总mTOR表达量无明显差异。进一步发现,LY294002使高糖组DNMT1表达增加,BDNF表达减少（P<0.05）,然而在正常糖组,LY294002不影响DNMT1及BDNF的表达。这些数据表明Akt通路影响高糖RSC96细胞的mTOR通路及DNMT1和BDNF的表达;Dorsomorphin显著增加正常糖和高糖mTOR磷酸化,Western blot检测结果显示:phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显升高（P<0.05）,总mTOR表达量无明显变化。进一步发现,Dorsomorphin使高糖组DNMT1表达下降（P<0.05）,而正常糖组DNMT1表达量无明显变化。与对照组相比,高糖组或正常糖组RSC96细胞中Pro-BDNF和mature-BDNF表达量无明显变化。结论:1.高糖通过增加BDNF外显子I和II的启动子甲基化导致雪旺氏细胞中BDNF的表达降低。2.DNMT1介导了高糖诱导的雪旺氏细胞中BDNF表达降低。3.Akt/mTOR途径参与高糖诱导的雪旺氏细胞中DNMT1表达的升高和BDNF表达的降低。