研究背景乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,其发病率一直高居女性各器官恶性肿瘤发病率之首,每年因乳腺癌死亡人数多达50多万。ErbB2过表达型乳腺癌是恶性程度较高、预后较差的乳腺癌分子亚型,约占乳腺癌患者的25~30%。紫杉醇作为乳腺癌化疗方案中重要的候选药物,被广泛地用于转移性乳腺癌的化疗实践中,也是ErbB2阳性乳腺癌新辅助治疗中采用最多的紫杉烷类。随着紫杉醇药物的广泛使用,原发和继发性紫杉醇耐药性的产生这一问题也日益凸显,鉴于目前对其相关耐药分子机制的了解甚少,这极大的限制了紫杉醇在乳腺癌综合治疗中的临床疗效。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性可以是内在的或是后天获得的。内在的耐药意味着一开始化疗就无效;获得性耐药是在肿瘤治疗过程发展的,可能是由于突变也可能是由于其他适应性反应如激活代偿信号通路引起的。ErbB2介导的耐药性增加是导致肿瘤恶性程度增强和病人存活率降低的重要原因,然而迄今尚未发现ErbB2自身可识别的配体,它必须与其它可识别相应配体的受体相互作用方可有效发挥其生物学功能。ErbB3与ErbB2同属于I型受体酪氨酸激酶(RTK)家族,是ErbB2最为重要的相互作用受体伙伴,经常共表达于ErbB2阳性乳腺癌细胞。我们先前的研究发现ErbB3活性升高可导致紫杉醇耐药,靶向抑制ErbB3可增强紫杉醇对ErbB2-过表达乳腺癌的抗肿瘤活性。ErbB2/ErbB3对下游信号转导通路的激活有赖于ErbB3与其配体NRG-1的有效结合,但研究发现ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞NRG-1的表达水平极低。近年来,肿瘤微环境在肿瘤生物学中的作用日益得到认可。间充质干细胞(也称间充质基质细胞,MSC)能够特异性的募集到包括乳腺癌在内的许多原发和转移的肿瘤部位,是构成肿瘤微环境的重要组成部分。MSC可通过旁分泌细胞因子、外泌体等方式影响肿瘤细胞生长、迁移和治疗耐药。然而,MSC与肿瘤细胞之间的相互作用关系复杂,既可能支持肿瘤生长,也可能抑制肿瘤生长,在不同分子亚型乳腺癌中甚至出现截然相反的结果;因此,进一步深入揭示MSC与特定分子亚型乳腺癌之间确切的相互作用关系及作用机制,阐明作为肿瘤微环境中一个大群体的MSC与肿瘤细胞的关系,有助于进一步了解实体肿瘤的耐药机制。研究目的探讨MSC对ErbB2/ErbB3共表达的乳腺癌细胞增殖以及对紫杉醇敏感性等肿瘤生物学行为的影响,并进一步探讨其可能的分子机理,冀望能拓展我们对肿瘤化疗耐药分子机制的认知水平,从而为临床ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌病人克服紫杉醇耐药和新的靶向治疗策略提供初步的实验依据。研究方法1.首先分离脐带来源的MSC作为细胞的种子来源,通过超滤法、超离法富集脐带MSC培养上清的外泌体,通过透射电镜鉴定外泌体的大小,WB和流式鉴定外泌体特异性标志物的表达。2.通过MTS和ELISA凋亡定量检测,分析MSC或其外泌体(0,1,2,5,10,20μg/ml)、重组NRG1对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的影响,以及对不同浓度紫杉醇(0,2,4,8,16,32 nM)诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。并通过平板克隆形成试验、流式凋亡分析等方法进行验证;qPCR和WB检测与增殖相关的细胞周期调控基因p21、p27、Cyclin D1、Cyclin E1的表达情况。3.通过PCR分析MSC和乳腺癌细胞的NRG-1基因mRNA的表达情况;WB分析MSC及其外泌体的NRG-1蛋白表达以及MSC外泌体、NRG-1作用后乳腺癌细胞ErbB3、Akt、MAPK等信号通路活化和Survivin、PARP等蛋白的表达情况,探讨MSC或其外泌体对乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药性影响的分子机制。4.构建慢病毒载体pLKO.1_NRG-1_shRNA,用NRG-1shRNA、ErbB3shRNA分别特异性敲低MSC的NRG-1表达和乳腺癌细胞ErbB3受体的表达后,通过平板克隆形成试验、凋亡分析以及WB检测Survivin、PARP蛋白等验证NRG1-ErbB3介导的信号通路在MSC诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药中的作用。再通过小分子抑制剂LY294002,Akt抑制剂VIII和YM155分别抑制乳腺癌细胞PI3K、AKT、Survivin,分析MSC外泌体对紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果1.从脐带wharton胶中分离出MSC,经鉴定符合MSC的标准。采用超滤法可以富集脐带MSC培养上清中的外泌体,经鉴定为30-100nm大小,表达CD9,CD63,CD81等外泌体标志,同时还表达脐带MSC的表面标志CD73,CD90,CD105,说明获得的外泌体来源于脐带MSC。2.MTS试验结果显示,以乳腺癌细胞MDA-MB-453单独培养组为对照(100%),MSC共培养组、加外泌体组乳腺癌细胞的增殖率分别为(116±2.53%,114.5±0.48%,n=3),与对照组相比没有统计学差异(p=0.061,p=0.092)。RT-qPCR结果显示,加入MSC外泌体组乳腺癌细胞周期调控相关基因CyclinD1、CyclinE1、p21和p27的表达水平无明显改变;与对照组相比分别增加(1.322±0.121倍,1.142±0.158倍,0.889±0.08倍和1.248±0.244倍,n=4),无统计学差异(p=0.125,p=0.171,p=0.068,p=0.135)。WB结果也证实细胞周期调控蛋白表达没有明显变化。3.平板克隆形成试验结果显示,随着紫杉醇浓度(0,2,4,8 nM)增加,乳腺癌细胞克隆数逐渐减少;与对照组相比,紫杉醇诱导凋亡中加入MSC共培养或重组NRG1,乳腺癌细胞克隆数明显增多。定量结果显示(n=3),对照组乳腺癌细胞活率分别为(100±1.19%,85.69±1.04%,51.71±0.60%,18.88±0.62%);MSC共培养组分别为(104±1.24%,92.44±1.2%,75.29±1.2%,46.78±0.22%);rNRG1组分别为(107±1.022%,94.24±0.67%,76.49±0.39%;40.69±0.37%);MSC和NRG1明显提高乳腺癌细胞对紫杉醇的耐受性,促进乳腺癌细胞存活(p=0.013,p=0.001,p=0.0001和p=0.0007,p=0.0003,p=0.0006)。4.MTS结果显示,在不同浓度紫杉醇诱导乳腺癌细胞MDA-MB-453凋亡模型中,随着紫杉醇浓度的增加,乳腺癌细胞存活率逐渐降低;加入MSC外泌体或rNRG1后,乳腺癌细胞活率明显提高,紫杉醇浓度(2,4,8nM)组具有明显差异(p<0.001)。并且,MSC外泌体降低乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性具有浓度依赖性,随着外泌体浓度的增加(0,1,2,5,10,20μg/ml),乳腺癌细胞活率增加;当外泌体浓度大于2μg/ml时,具有统计学差异(p=0.0518,p=0.018,p=0.008,p=0.0003,p=0.0001)。5.细胞凋亡分析结果显示,MSC外泌体显著降低了紫杉醇对乳腺癌细胞的诱导凋亡作用(p=0.0009,n=3);凋亡相关指示蛋白PARP活性剪切体cleaved-PARP表达降低。流式细胞凋亡分析结果也证实,MSC外泌体明显抑制紫杉醇引起的乳腺癌细胞凋亡(加入MSC外泌体组,紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡率由43.2±0.71%降至23.35±0.64%,p<0.01,n=3)。6.MSC及其外泌体高表达ErbB3的配体NRG-1,乳腺癌细胞不表达;MSC外泌体可明显激活MDA-MB-453乳腺癌细胞ErbB3受体,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,而MAPK信号通路不受影响。当MSC细胞的NRG-1被shRNA特异性敲低或MSC外泌体NRG-1被特异性抗体中和后,MSC及其外泌体的作用效果被逆转。当乳腺癌细胞ErbB3被shRNA特异性敲低,或当PI3K、AKT、Survivin被小分子抑制剂特异性抑制后,乳腺癌细胞凋亡增加,MSC外泌体对对乳腺癌细胞紫杉醇耐药的影响也被消除。结论1.通过超滤离心法可以较简便地对MSC条件培养基中的外泌体进行富集。2.MSC没有明显促进ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞MDA-MB-453增殖,但是MSC明显降低乳腺癌细胞对化疗药紫杉醇的敏感性,促进肿瘤细胞的存活。3.MSC通过外泌体旁分泌NRG-1,通过与Erb3/ErbB2介导的信号级联反应,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,抑制细胞凋亡,诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞对紫杉醇耐药性。4.特异性靶向抑制MSC的NRG-1或肿瘤细胞的ErbB3、PI3K、AKT、Survivin,可消除MSC诱导的ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞紫杉醇耐药。5.研究结果表明靶向肿瘤微环境中的MSC,可能是克服ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌患者中紫杉醇耐药性的新策略