研究背景前列腺癌作为一种男性恶性肿瘤,在欧美等国非常常见。近年来随着我国经济生活水平的提高,饮食及文化相关的发展,社会的老龄化及查体的普及,前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。前列腺癌患者发病时一般较晚,许多患者发现时已发生转移,其最常见的转移为骨转移。而研究发现前列腺癌患者的高病死率与其高转移率密切相关,因此,人们越来越关注针对前列腺癌患者转移相关的治疗。上皮间质转化(EMT)是指原位肿瘤细胞,在受到物理或化学因素的作用下,从而失去了细胞极性、细胞间黏附等上皮细胞的特性,并获得间质细胞的特性时,转化成为能够向细胞外基质侵袭并向远处转移的细胞。上皮间质转化(EMT)已被证实在前列腺癌转移过程中发挥着重要作用,其调控机制由多个信号通路综合参与引导,包括GF-β、Notch、Wnt以及ERK/MAP K等通路。其中TGF-β/SMAD4通路对肿瘤特别是晚期时的EMT发展密切相关。SMADs是哺乳动物TGF-β超家族信号传导的下游信号蛋白,它们可将GF-β信号由细胞膜转导进入细胞核,并与DNA及一些转录因子相互作用。SMAD4即在TGF-β/SMAD4信号通路中起到关键的“渡船”的作用。因此当抑制SMAD4的表达时,可以抑制TGF-β通路信号传递,阻止上皮间质转化(EMT)在肿瘤细胞中发生。近年来发现的miRNA是一组非编码小RNA,其作用涉及众多生理、病理过程,主要表现为抑制mRNA的翻译或诱导其降解,从而改变靶蛋白的表达水平。关于miRNA的研究成为当前的热点,大量研究证明miRNA在不同的肿瘤中均有不同的表达,且发挥着重要的作用：例如部分miRNA对肿瘤细胞中的EMT起促进作用,而部分miRNA对肿瘤细胞中的EMT起抑制作用。因此将来治疗肿瘤通过研究针对miRNA靶向治疗药物会有很大的发展前景。目前大量的研究表明,丙戊酸钠(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)细胞转移并且相应的下调SMAD4蛋白表达水平。然而VPA对前列腺癌细胞中SMAD4表达产生调控的过程中,是否存在miRNA的参与,这其中涉及的具体机制目前尚不清楚。如果通过实验找到影响SMAD4表达的核心miRNA,就可以针对该miRNA的作用机制研究相关的药物治疗。这种针对性更强的治疗可能会效果更好且可以减少并发症,对前列腺癌的治疗将有着重要的意义。目的前期研究已证实丙戊酸钠(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)细胞转移,并且能通过下调SMAD4表达水平阻断EMT的发生。通过本实验,我们研究丙戊酸钠(VPA)通过何种途径下调SMAD4蛋白表达水平,寻找是否存在相关的miRNA与其调控密切相关,找到这种miRNA并探索能否通过该miRNA的调控,改变SMAD4的表达水平,从而确定其是否在SMAD4的表达过程中起到关键作用,为前列腺癌的治疗寻找新的治疗靶点。方法我们通过使用www.targetscan.com查找可以与SMAD4互补结合miRNAs,然后通过在PubMed上搜索及进行文献复习确定与VPA相关的miRNA,将同时与SMAD4及VPA相关的miRNA作为我们的研究对象。实验设计首先培养两种前列腺癌细胞株(PC3、LNCaP),在应用VPA处理后,检测SMAD4的蛋白和mRNA水平有无变化,变化有无统计学差异。再次用VPA处理前列腺癌细胞株,观察是否对作为研究对象的miRNA表达水平产生影响。选择应用VPA处理后的变化有统计学差异的miRNA进行下一步实验。通过质粒转染技术,分别植入转染相应miRNA前体及miRNA抑制剂后,检测其对前列腺癌细胞中SMAD4表达的影响。选出对SMAD4表达产生有统计学意义影响的miRNA作为最终目标。最后将通过相应的miRNA抑制剂将选出的目标miRNA的表达进行抑制,观察其能否消除VPA对SMAD4的影响,以评价其是否在VPA抑制SMAD4的表达过程中起到关键的作用。结果通过使用www.targetscan.com查找可以与SMAD4互补结合miRNAs,然后通过在PubMed上搜索及文献复习确定与VPA相关的miRNA,我们将同时与SMAD4及VPA相关的5种miRNA作为我们的研究对象进行实验,分别是miR-20a, miR-34a, miR-124a,miR-144和miR-449a。我们通过实验再次验证在经过VPA处理后,前列腺癌细胞株中SMAD4的mRNA和蛋白的水平均明显下调,且具有明显的浓度依赖性。之后我们用VPA处理前列腺癌细胞株,从初步筛选的5种miRNA中,发现miR-20a、miR-34a与miR-449a的表达水平在VPA处理后增加且具有统计学意义,而对miR-124a, miR-144的表达则无明显变化。因此我们将miR-20a、miR-34a与miR-449a作为下一步的研究目标。我们通过质粒转染技术,在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中分别植入转染miR-20a、miR-34a与miR-449a前体及miR-20a、miR-34a与miR-449a抑制剂后,发现通过转染pre-miR-34a降低SMAD4的表达,而转染pre-miR-20a或者pre-miR-449a则均增加了SMAD4的表达,且SMAD4表达的变化均有统计学差异；而通过转染miR-34a抑制剂,增加了SMAD4的表达；而转染miR-20a或者miR-449a抑制剂,则均减少了SMAD4的表达。在前列腺癌细胞株LNCaP中,通过转染miR-34a抑制剂后SMAD4表达的变化有统计学差异,而转染miR-20a抑制剂或者miR-449a抑制剂后SMAD4表达的变化无统计学差异。在前列腺癌细胞株PC3 cells中,通过转染pre-miR-34a抑制剂、pre-miR-20a抑制剂、pre-miR-449a抑制剂后SMAD4表达的变化均有统计学差异。通过实验我们发现转染miR-34a的前体及抑制物均能对SMAD4的蛋白及mRNA表达水平有显著的影响,miR-34a在VPA影响SMAD4表达过程中应该起到重要作用,因此我们选择miR-34a作为研究对象进入下一组实验。在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中,通过转染pre-miR-34a抑制剂来增加SMAD4蛋白水平的表达,然后再加用VPA处理,SMAD4蛋白水平并没有明显改变,无统计学差异。同时在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中,应用转染pre-miR-34a抑制剂后再应用VPA处理,SMAD4的mRNA水平的变化也无统计学差异。结果表明降低miR-34a的表达可消除VPA对SMAD4的抑制效果。即上调miR-34a水平可模拟SMAD4被VPA抑制时的效果,而下调miR-34a的水平消除VPA在前列腺癌细胞的影响。结论丙戊酸钠(VPA)可上调miR-20a, miR34a, miR449a在前列腺癌细胞株LNCaP和PC3中的表达水平。抗癌miRNA中的miR-449a在经过VPA治疗后其表达明显上调,这提示miR-449a可能参与VPA的其它复杂的作用机制。pre-miR-20a或pre-miR-449a转染诱导了SMAD4蛋白水平上调,这可能主要是由于间接的影响。VPA作用下miR-34a表达增强可隐藏miR-20a和miR-449a对SMAD4的表达效果。miR-34a是在VPA抑制SMAD4的表达过程的一个关键调节因子。VPA通过上调rmiR-34a的表达,从而抑制了SMAD4的表达。