哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种进化上高度保守的丝/苏氨酸蛋白质激酶,属于磷脂酰肌醇激酶(PI3K)相关激酶蛋白质家族成员。mTOR在细胞的生长、代谢、存活中起重要作用,其在细胞内可形成两种多蛋白复合体:mTORC1和mTORC2。mTORC1主要组成蛋白是Raptor、mTOR、GβL、DEPTOR 和 PRAS40,mTORC2 主要由 Rictor、mTOR、GβL 和 SIN1组成。其中Raptor和Rictor分别是定义mTORC1和mTORC2的关键蛋白。mTORC1与蛋白质、脂质合成,细胞生长代谢等有关,mTORC2可磷酸化下游Akt、PKC等蛋白,调控胚胎发育、肿瘤形成、心肌缺血损伤时的心肌保护等。研究报道,mTORC2缺失可阻滞胚胎和胚外组织的发育,但关于mTORC2在心脏发育中功能和机制的研究还处于初始阶段,亟待进一步探索。胚胎干(EmbryonicStem,ES)细胞是一种来源于囊胚期内细胞团,可进行自我更新和分化为生物体内各种不同类型细胞的全能干细胞。ES细胞可体外定向分化为功能性心肌细胞,已应用于心脏疾病的细胞再生治疗、新药发现等研究领域,但心肌细胞分化是一个复杂过程,其中的调控机制目前尚没有完全研究清楚。本课题组前期研究发现干扰Rictor/mTORC2可抑制ES细胞定向心肌细胞分化,且可导致分化后心肌细胞肌小节排列不规则、电生理功能紊乱等现象,但关于Rictor/mTORC2如何调控ES细胞定向分化为心肌细胞的机制尚不明确,亟待深入探索。在胚胎发育过程中,心脏是最先形成并发挥功能的器官之一。心肌细胞拥有最大的线粒体密度,对能量需求很高。近年来,研究者们越来越多地从线粒体角度来研究心脏形成及发育机制。研究表明,线粒体功能状态在维持干细胞的多能性和分化中发挥着重要调节作用。在ES细胞分化为心肌细胞过程中,线粒体能量代谢从厌氧糖酵解形式转变为氧化磷酸化方式,以产生更多能量用于分化和满足跳动心肌细胞的兴奋收缩偶联。近年来研究发现,线粒体和内质网之间存在一种偶联结构(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM),该结构主要通过线粒体融合蛋白2(Mitofusion,Mfn2)和葡萄糖调节蛋白75(Glucose regulated protein 75,Grp75)起连接作用,其中Grp75与内质网上的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3 Receptor,IP3R)和线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channel,VDAC)相互偶联形成复合物,Ca2+可从内质网通过此复合物通道传递到线粒体,线粒体内一定浓度的Ca2+可促进ATP合成。有研究报道,mTORC2在MEF细胞中定位于内质网和MAM结构,mTORC2的缺失会破坏这种偶联结构,造成线粒体功能缺陷。因此,本研究拟探索Rictor/mTORC2在ES细胞分化而来心肌细胞中的表达定位及对MAM结构和功能的影响。同时,从线粒体功能角度,论证Rictor/mTORC2表达调控与心肌细胞分化发育过程中线粒体功能的关联性。Cx43是构成心肌细胞缝隙连接的主要蛋白,在心肌缺血预保护及心肌细胞间电生理偶联等生理病理过程中起着重要作用。除位于细胞间连接外,Cx43也被证实定位于线粒体。线粒体Cx43参与调控线粒体能量代谢、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成、线粒体钾离子流动等。线粒体Cx43主要通过胞浆中的分子伴侣热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)转运到线粒体外膜,传递给外膜转位蛋白20(Translocase of outer membrane,TOM20),最后转运至线粒体内膜。我们前期研究发现,干扰Rictor可导致小鼠ES细胞衍生心肌细胞(ES cell-derived cardiomyocytes,ESC-CMs)缝隙连接蛋白Cx43分布减少且呈无规则散点状分布,可能是引起电生理活动紊乱的原因之一。本研究力图探索线粒体Cx43是否参与Rictor/mTORC2调控小鼠ES细胞分化为心肌细胞过程中线粒体功能,为更深入研究Rictor/mTORC2影响心肌分化发育的机制提供依据。线粒体上存在一种非特异性多蛋白孔道,即线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP),是线粒体内外信息交流的中心枢纽。mPTP主要由线粒体外膜蛋白VDAC、线粒体内膜蛋白腺苷酸转运酶(Adenine nucleotide translocase,ANT)、线粒体基质蛋白亲环蛋白 D(Cyclophilin D,CypD)组成。mPTP的开放会引起内膜屏蔽功能丧失,导致线粒体膜电位下降,进而导致呼吸链功能破坏,ATP生成减少。研究报道,Akt、GSK3β、Cx43与mPTP开放有关,Akt可磷酸化GSK3β Ser9位点,使其失活,抑制mPTP开放。GSK3β可在线粒体中与mPTP组成蛋白ANT相互结合,提高mPTP开放阈值,从而保护线粒体。线粒体Cx43是GSK3β的下游信号分子,激活线粒体Cx43可减轻钙诱导的mPTP开放,但线粒体Cx43与mPTP直接关系目前尚未见报道,我们推测线粒体Cx43可能与mPTP成分间存在相互作用,Rictor/mTORC2可能通过Akt-GSK3β通路作用于线粒体Cx43,影响mPTP的开启,最终影响心肌细胞线粒体功能。因此,本研究主要利用小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞模型,探索干扰Rictor致心肌细胞分化发育中线粒体损伤作用及相关机制,旨在揭示Rictor/mTORC2定位表达对心肌细胞中MAM结构及功能的影响,阐明Rictor/mTORC2经由线粒体Cx43影响呼吸链酶活性和mPTP开放,调控心肌细胞线粒体功能的相关机制。这有利于更深入理解Rictor/mTORC2在心肌发育中的生理功能,为探究心肌分化诱导剂的作用新靶点提供依据,也可为诱导性多潜能干细胞(ips细胞)应用研究提供有益借鉴。目的:利用小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞模型,探索Rictor/mTORC2对ES细胞定向分化心肌细胞线粒体功能的调控作用及机制,揭示Rictor/mTORC2的定位表达与心肌细胞中MAM结构及功能的关联性;阐明Rictor/mTORC2经由线粒体Cx43调控心肌细胞线粒体功能的相关机制。实验方法:采用慢病毒技术干扰小鼠ES细胞中Rictor表达,通过经典"悬滴-悬浮-贴壁"三步法建立小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞模型。利用Western Blot技术考察在ES细胞定向心肌细胞分化过程中Rictor表达变化。采用免疫荧光、Western Blot及免疫共沉淀技术考察Rictor在ESC-CMs中定位情况。利用流式细胞术和Western Blot检测干扰Rictor对小鼠ES细胞定向心肌分化的影响。采用MTT法检测干扰Rictor对小鼠ES细胞活性影响。利用Western Blot考察干扰Rictor对mTORC2其它组分(SIN1,GβL,mTOR,p-mTORSer2481)以及p-AktSer473表达水平的影响。采用ATP试剂盒检测干扰Rictor对ESC-CMs中ATP产生的影响。用JC-1染色和流式细胞术考察干扰Rictor后ESC-CMs线粒体膜电位变化。利用Western Blot技术检测干扰Rictor对ESC-CMs中凋亡早期蛋白细胞色素C表达的影响。采用透射电镜技术考察干扰Rictor对ESC-CMs超微结构(线粒体、MAM结构)的影响。通过Western Blot技术检测干扰Rictor对ESC-CMs中Mfn2表达的影响。用免疫共沉淀技术检测IP3R-Grp75-VDAC1结合情况,考察干扰Rictor对ESC-CMs中MAM偶联结构的影响。通过活细胞工作站测定分化后心肌细胞线粒体钙瞬变。采用Western Blot技术和免疫荧光技术考察干扰Rictor对ESC-CMs中Cx43、HDAC6表达水平的影响。运用免疫共沉淀技术考察干扰Rictor对ESC-CMs中Cx43与Hsp90、TOM20,Hsp90与acetyl lysine结合的影响。用慢病毒技术特异性过表达小鼠ES细胞线粒体Cx43,采用ATP试剂盒和流式细胞术检测过表达线粒体Cx43对ESC-CMs中ATP产生以及线粒体膜电位的影响。同时采用流式细胞术考察过表达线粒体Cx43对心肌细胞分化率的影响。利用线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、V活性检测试剂盒检测干扰Rictor及过表达线粒体Cx43对ESC-CMs酶复合物活性的影响。利用荧光染色及免疫共沉淀技术检测ESC-CMs中基质蛋白CypD与内膜蛋白ANT的相互作用来评价mPTP开放情况。用Western Blot技术检测干扰Rictor对Akt、p-AktSer473、GSK3β、p-GSK3βSer9表达水平的影响。采用免疫共沉淀技术考察 ESC-CMs 中 Cx43、p-Cx43Ser368、ANT、CypD、GSK3β、p-GSK3βSer9相互结合及干扰Rictor和过表达线粒体Cx43对这种相互作用的影响。实验结果:1.在小鼠ES细胞分化为心肌细胞过程中,Rictor表达逐渐上调。ES细胞干扰Rictor导致其定向心肌细胞分化率显著下降,心肌特异性蛋白α-Actinin显著下调。Rictor主要定位于内质网及MAM结构。免疫荧光和免疫共沉淀结果显示,在ESC-CMs中,Rictor与线粒体及内质网有很好共叠加,且与MAM结构中IP3R、Grp75、VDAC1有相互作用。mTORC2组成成分中表征mTORC2活性及完整性的Rictor、SIN1、p-mTORSer2481和p-AktSer473在干扰Rictor后表达显著下调。干扰Rictor后拟胚体(embryoid bodies,EBs)(day 5)和 ESC-CMs(day 5+3)的 ATP 产量显著降低。JC-1染色及流式细胞术结果发现干扰Rictor组ESC-CMs线粒体膜电位显著下降,但细胞色素C无显著变化。透射电镜结果显示,干扰Rictor组ESC-CMs线粒体内嵴肿胀,出现空泡,而对照组线粒体内嵴排列整齐,提示干扰Rictor可使分化后心肌细胞线粒体形态出现损伤。活细胞工作站结果显示,干扰Rictor后ATP刺激引起的线粒体钙瞬变幅度较对照组显著下降。进一步研究发现干扰Rictor引起MAM结构减少,且内质网与线粒体重叠率显著下降,MAM结构复合物IP3R-Grp75-VDAC1相互结合减弱,Mfn2表达减少,说明干扰Rictor导致ESC-CMs中MAM结构受到破坏,可能是引起内质网-线粒体钙穿梭减少的原因之一。以上结果提示干扰Rictor可导致ESC-CMs线粒体ATP产生减少,膜电位下降,线粒体出现肿胀及空泡,但不引起细胞凋亡。同时干扰Rictor减少ESC-CMs中MAM结构,破坏其完整性,使线粒体钙瞬变幅度下降。2.干扰Rictor组ESC-CMs中Cx43在线粒体中定位减少,且Cx43总蛋白含量下降,线粒体Cx43表达减少,而胞浆Cx43表达有所增加,这提示干扰Rictor导致ESC-CMs线粒体Cx43表达减少,可能是由于由胞浆转运至线粒体的Cx43减少所致。免疫共沉淀实验结果发现,干扰Rictor组Cx43与Hsp90及TOM20相互作用显著弱于阴性对照组。同时,Western blot结果发现Hsp90脱乙酰化调控蛋白HDAC6表达水平在干扰Rictor后显著降低,Hsp90乙酰化程度增加,提示干扰Rictor致ESC-CMs中Cx43转运至线粒体减少可能与HDAC6表达减少,Hsp90乙酰化程度增加,Cx43与转运蛋白Hsp90和TOM20结合减少有关。3.过表达线粒体Cx43后EBs及ESC-CMs中ATP产量较干扰Rictor组显著增加,且线粒体膜电位有所增加。提示过表达线粒体Cx43可逆转干扰Rictor导致的ESC-CMs线粒体功能受损。同时流式细胞术检测心肌细胞分化率结果显示,过表达线粒体Cx43组心肌分化率较干扰Rictor组显著增加,说明过表达线粒体Cx43提高线粒体功能可逆转干扰Rictor对心肌分化的抑制作用。线粒体呼吸链酶复合物活性检测结果发现,干扰Rictor显著下调ESC-CMs线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的酶活性,而过表达线粒体Cx43可提高酶复合物Ⅰ、Ⅳ的活性。干扰Rictor导致ESC-CMs中mPTP开放程度显著增加,过表达线粒体Cx43可抑制mPTP开放。进一步研究发现,干扰Rictor显著下调ESC-CMs中p-AktSer473,p-GSK3βSer9表达水平,抑制线粒体 p-GSK3βSer9与 Cx43、p-Cx43Ser368,Cx43、p-Cx43Ser368 与ANT、CypD相互结合,促进mPTP开放。以上结果提示干扰Rictor一方面通过抑制Cx43转运至线粒体内膜,减少线粒体Cx43表达,从而降低ESC-CMs线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ的活性,另一方面,干扰Rictor通过抑制ESC-CMs中Akt-GSK3β通路,减弱Cx43与mPTP组成蛋白结合能力,促进mPTP开放,最终破坏心肌细胞线粒体呼吸链,损伤线粒体功能。结论:1.ES细胞体外定向分化心肌细胞中Rictor呈发育依赖性上调,且定位于ESC-CMs内质网和MAM结构。干扰Rictor抑制小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞。同时干扰Rictor破坏mTORC2完整性和抑制其活性,致ESC-CMs线粒体内嵴肿胀甚至出现空泡,降低线粒体膜电位,破坏ESC-CMs中MAM结构,降低IP3R介导的线粒体钙瞬变,减少ATP产量,损伤线粒体功能,但不引起线粒体依赖的细胞凋亡。2.干扰Rictor致ESC-CMs线粒体功能损伤的作用机制一方面与其抑制Cx43转运至线粒体内膜,减少线粒体Cx43表达,从而降低线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ活性有关;另一方面与Rictor经由Akt-GSK3β通路,减弱Cx43与mPTP组成蛋白结合,由此促进mPTP开放有关。