肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌中一种比较常见的病理类型,属于非小细胞癌,大约占肺癌发病总数的40%左右。肺癌有许多呼吸道以及心血管系统并发症,治疗仍以手术为主,对于无法手术的中、晚期患者则以放疗和化疗为主。如果得不到及时的控制,急速恶化下去,对患者的生命产生极大的威胁,并造成沉重的个人和社会负担。肺部腺癌一般起源于细小支气管粘膜上皮,少数起源于大支气管的粘液腺。疾病发生的确切机制目前尚不明确。近年来致力于机制研究的国内外学者从组织酶学、癌基因突变研究、细胞因子信号转导、生长因子调控及其受体通路等方面对肺癌发生的机制从分子水平进行了详细深入的研究。结果发现肺腺癌组织中某些生长因子、信号转导分子基因表达上调；同时与细胞分化、增殖、凋亡有密切相关的蛋白质表达也发生了相应的改变。近年来兴起的靶向治疗已经取得了良好的效果,从某种意义上做到了“个体化治疗”,疗效确切。而这项新治疗方法的应用得益于对肺癌发病机制的深入研究,使得可以在分子病理的基础上做到对肿瘤细胞的精确打击。新近的研究证实了细胞的基本生物过程,包括增殖、分化和死亡,均受到一类小分子RNA的调控,这类小分子RNA被称为MicroRNA (miRNA),它们的长度通常在20-30nt左右。MicroRNA对细胞的调控作用是通过对目的信使RNA (mRNA)的3’-N端的非翻译区的相应位点结合以后,沉默靶基因表达,影响蛋白质翻译,进而调控细胞的各种生物学功能,从而实现对疾病进程和预后的影响。MicroRNA并不是常规的遗传物质,而是一种重要的调节因子,在蛋白质翻译过程中,起到重要的调节作用。研究发现60%左右MicroRNA结合位点的定位都与肿瘤及异常增生性疾病相关。据计算分析,在所有执行蛋白编码的基因中,MicroRNA的数量大约有3%,同时有高达40%的蛋白编码基因可以做为靶基因而可能受到miRNA的调控。已知的miRNA相关研究中,除了少数几个公认在各类肿瘤中都有异常表达的微小RNA家族外,其他研究的结果并非完全一致,造成这种局面的原因与microRNA的数目繁多,调控机制复杂,所影响的靶基因及其相应的信号通路交联繁浩有着直接的关系。另外,在不同种类的疾病,不同疾病进程,不同地区及国家人种间,很多潜在的因素均可影响到microRNAs的表达水平。本研究从所在地就诊患者人群为研究样本,开展了肺腺癌与microRNA关系的研究,拟探讨在本地区患病人群中,microRNA与疾病发生发展的联系。本课题前期的研究结果显示,除外miR-21以外,在肿瘤组织中miR-182,miR-155,miR-197,miR-210均有着较正常对照异常升高的表达水平,其中又以miR-155的差异表达倍数为最高(除外miR-21)。考虑到miR-21在研究比较成熟,在各类型肿瘤性疾病中都有显著升高的表达,本课题依据前期预实验结果,选择miR-155为研究对象,观察其在体内外肺腺癌中的表达水平,并试图探讨其在肺腺中异常表达的机制。人类MicroRNA-155(Hsa-miR-155,miR-155)是已确认的microRNAs家族中重要的成员。新近证实在动物实验中,miR-155在肺癌组织中的表达发生异常,表达水平明显高于同体正常肺组织,且亦有临床调查研究提示miR-155与肺癌患者的预后有密切相关。但目前关于miR-155的系统研究,尤其在与肺癌发生发展及具体机制还比较少,而具体到miR-155对肺腺癌细胞增殖分化或死亡调控作用的研究则更未见报道。miR-21是研究最早而且最深入的miRNAs之一,在本研究中它不是研究对象,对miR-21的检测只是为了作为阳性对照,可以为课题研究对象miR-155的表达提供参照和参考。我们通过观察并详细分析miR-155在肺腺癌组织及患者血清中的表达,并使用慢病毒体外转染miR-155抑制剂来观察其对人肺癌A549、SPC-A-1、 LTEP-a-2细胞体外生长的影响,探讨其可能的作用机制,为进一步深入研究miR-155与肺癌的关系提供前期理论基础和实验依据。研究目的1.观察肺癌相关MicroRNA在肺癌组织和健康组织中的表达,尤其是MicroRNA-21、MicroRNA-155在肺癌病人和健康对照组织中的差异表达情况,研究4icroRNA-155在肺腺癌增殖和凋亡中的作用。2.检测4icroRNA-21、MicroRNA-155在肺癌病人和健康对照人群血清中的差异表达情况,评价miR-155在肺癌发生发展各阶段的差异表达情况,以及做为新近肿瘤标记物在预测肺癌早期检测中的价值。3.建立肺腺癌细胞系体外研究模型,研究MicroRNA-155在肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEP-a-2中的表达情况。使用介导MicroRNA-155抑制体(miR-155 Inhibitor)的慢病毒载体,分别转染miR-155 Inhibitor至体外培养的A549、SPC-A-1、LTEP-a-2细胞中,观察下调MicroRNA-155在细胞中的表达后,对肺腺癌细胞生长增殖以及侵袭凋亡能力的影响。4.以介导MicroRNA-155抑制体的慢病毒载体,分别转染miR-155 Inhibitor至体外培养的A549、SPC-A-1、LTEP-a-2细胞中,观察下调MicroRNA-155对肺癌细胞中MicroRNA-155及其靶基因PTEN (phosphatase and tensin homolog)、 PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)蛋白表达的影响,为开展基于miRNA的靶基因治疗提供依据。第一部分miR-21、miR-155在人肺腺癌组织中的表达方法1.从36例肺腺癌手术患者所切除的组织中,选取癌变以及正常组织,分别提取其中的微小RNA (<～200nt),通过Nanodrop(?)分析仪测量吸光值来检测所提取RNA的纯度和浓度。2.使用实时荧光定量PCR技术,检测癌变以及正常组织中miR-21、miR-155的表达情况。3.半定量实时荧光RT-PCR技术检测各不同肺腺分期的患者肿瘤组织中miR-21、miR-155的表达情况。结果1. miR-21、miR-155在肺腺癌患者肿瘤组织中及正常对照组织中均可检测到,结果稳定可靠。2. miR-21、miR-155在肺腺癌患者组织中的表达高于正常对照组织中的表达；miR-21在各组组织中的表达均高于miR-155的表达(P<0.05)。3.检测miR-21、miR-155在各期肿瘤患者组织中的表达,提示各期中均以STAGEⅠ中的表达最低。miR-21在STAGE Ⅱ, STAGE Ⅲ,STAGE Ⅳ中表达均有升高,以STAGE Ⅲ最高,差异有统计学意义(P<0.05)。4. miR-155在各期肿瘤患者组织中的表达显示,STAGEⅠ中的表达水平最低,依次升高为STAGE Ⅳ, STAGE Ⅲa中升高,最高为STAGE Ⅱ以及STAGE Ⅲb。STAGE Ⅱ STAGE Ⅲ与STAGEⅠ相比,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分miR-21、miR-155在肺腺癌病人血清中的表达方法1.随机选择36名肺腺癌患者和32名健康对照,入组病人按照肺腺诊断病理标准严格入组并排除其他疾病。健康对照组排除肺部及肿瘤性疾病。采用离心法对肺腺癌病人血液和健康对照组血液进行离心收集,取得血清样本。2.提取各血清样本中的微小RNA(<～200nt),通过Nanodrop(?)分析仪测量吸光值来检测所提取RNA的纯度和浓度。3.实时荧光定量PCR技术检测miR-21、miR-155在各样本中的表达情况。4.结合样本CEA、CA-125检测值,联合miR-155进行ROC曲线分析。结果1.从人血清中获取足够数量的MicroRNA,用于扩增检测。2.以miR-155在健康组中的表达做为参照对象,定义为“单位1”,miR-155在肺腺癌病人血清中的表达与其相比,是它的2.03±0.34倍,miR-21在肺腺癌病人血清中的表达是健康对照血清的4.06±1.43倍,差异有统计学意义(P<0.05)。3.miR-155在各期肺腺癌患者血清中均可稳定检测到表达,其中在II期患者血清中的表达高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.ROC分析显示,在肺腺癌的诊断中miR-155比CEA、C A-125有更好的特异性,miR-155与CA-125的联合检测分析可以提高肺腺癌的诊断效能。第三部分下调MicroRNA-155在肺癌细胞中的表达对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响方法1.实验对象选择A549, SPC-A-1, LTEP-a-2三个常用肺腺癌细胞系进行干预和观察。各肺腺癌细胞系实验分组：Mock组(空白对照组)未干预肺癌细胞miR-155 Inhibitor组(实验组),miR-155NC组(阴性对照组)。2.利用介导MicroRNA-155Inhibitor的慢病毒载体感染培养的肺腺癌细胞,荧光显微镜观察病毒感染效率,荧光定量PCR技术检测MicroRNA-155的表达,初步确定MicroRNA-155Inhibitor的干扰效能。3.将未干预细胞及感染慢病毒后的肺腺癌细胞以2×104/ml密度接种于96孔板中,培养120小时,每12小时取出3孔计数细胞并记录,绘制细胞生长曲线。4.细胞处理同上一步骤,于96小时中止培养并取各组细胞运用PI进行染色；之后利用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测细胞周期的分布。5.细胞转染接种同时给予EdU添加,培养48小时后使用Apollo(?)及Hoechst3342标记的染色剂结合后,在荧光显微镜下察看细胞增殖的情况。转染后48小时,使用Transwell侵袭实验检测转染后细胞侵袭能力的改变情况。6.细胞经慢病毒转染72小时后分别利用Annexin V-FITC法观察细胞早期凋亡；同时TUNEL标记原位酶,利用荧光显微镜观察检测细胞凋亡情况。7.WesternBlot检测肺腺癌细胞经MicroRNA-155 Inhibitor干扰后,各细胞系中PTEN和PI3K蛋白表达的变化。结果1.各肺癌细胞系中Inhibitor组miR-155的表达显著低于相应NC组和Mock组,miR-155在NC组中的表达是Inhibitor组的8.15±0.37倍,Mock组中的表达是Inhibit or组的10.32±±0.67倍,差异有统计学意义(P<0.05)；而在NC组和Mock组的组间表达经分析无统计学差异(P>0.05)。3.经MicroRNA-155 Inhibitor转染干扰后的肺腺癌细胞系的细胞生长和增殖受到抑制,转染后36小时Inhibitor组的细胞密度与NC组和Mock组进行比较分析,差异有统计学意义(P<0.05),转染后60小时开始,两对照组细胞均呈指数增殖,Inhibitor组仍缓慢增殖。4. MicroRNA-155 Inhibitor转染至各肺腺癌细胞培养96小时行FCM检测细胞周期显示：较NC组和Mock组,G0/G1期细胞比例增加而S期细胞比例下降(P<0.05)。5. MicroRNA-155 Inhibitor转染至各肺腺癌细胞培养96小时后,EdU检测阳性染色标记细胞数,EdU阳性细胞数明显低于NC组和Mock组,]1 nhibitor组细胞增殖率较另外两组明显降低(P<0.05)6. MicroRNA-155 Inhibitor转染培养96小时后, Annexin V-FITC检测细胞早期凋亡率较NC组和Mock组有明显增加(P<0.05);TUNEL细胞原位杂交显示晚期凋亡细胞比例明显增加(P<0.05)7. MicroRNA-155 Inhibitor组侵移生长至Transwell小室膜外侧的细胞数较相应NC组和Mock组中侵移生长的细胞数明显减少(P<0.05)。8. PTEN蛋白在各肺腺癌细胞Inhbitor转染组的表达高于未转染和非相关转染对照组中的表达(P<0.05),PI3K在肺腺癌细胞Inhbitor转染组中的表达低于未转染和非相关转染对照组中的表达(P<0.05)。结论1.肺腺癌患者肿瘤组织miR-155的表达较正常组织增高,不同分期肿瘤患者组织中miR-155有差异性表达。2.肺腺癌病人血清中可稳定连续检测到miR-155的升高表达,以Ⅱ期患者中升高明显。miR-155在患者血清中的差异性表达可以为肺腺癌的临床早期诊断提供参考。3.体外培养的肺腺癌细胞中可检测到增高的miR-155表达,转染相应的Inhibitor后可有效沉默其在各细胞系中的表达,且使细胞周期中Go/G1期至S期发生生长阻滞。抑制miR-155在肺腺癌细胞中的表达,可以抑制癌细胞增殖,促进其凋亡,抑制细胞侵袭。4.通过介导miR-155 Inhibitor的慢病毒载体转染肺腺癌细胞系后,各细胞系中PTEN蛋白表达升高,P13K蛋白表达降低,miR-155对靶基因的调控可能与PI3K-AKT-mTOR信号转导通路相关。