研究背景:胶质瘤是最为常见的中枢神经系统肿瘤,其中约半数患者为胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）,约占成人恶性肿瘤总数的2%,即使经过手术、放疗、化疗等措施,患者的中位生存时间也仅在12～15个月左右[1.2],并常伴随着如认知障碍、癫痫等症状,极大的降低了患者的生存质量,是最为致命的成人恶性肿瘤之一,因此新的治疗方式及治疗药物的研究仍为当下热点。沙利度胺（Thalidomide THA）因为其严重的致畸作用被长期禁用,在对其致畸机制的研究中发现其对于实体肿瘤的治疗具有明显效果,可通过抑制血管生成[3]、免疫调节[4]、诱导凋亡[5]等机制抑制肿瘤的生长、促进肿瘤的凋亡,在肝[7]、肺[8]、骨[9]等实体肿瘤的治疗实验中取得了明显的效果,在一项胶质瘤临床治疗试验中,沙利度胺联合放化疗不仅改善了患者的生活质量,并且远期效果明显好于对照组[10],在沙利度胺治疗多种胶质瘤细胞株的实验中,均能发现明显的治疗效果[11]。但沙利度胺是否能诱导肿瘤细胞发生程序性坏死并没有阐明。研究目的:本实验从细胞及动物实验两个水平进行研究,验证沙利度胺是否能通过激活程序性坏死通路中受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）/受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）诱发鼠C6胶质瘤细胞的程序性坏死,并对鼠C6胶质瘤细胞产生治疗效果。方法:1.细胞毒性/增殖检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）测定检测细胞增殖情况。计算对照组、Thalidomide（0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L）处理后的细胞增殖抑制率及IC50。确定沙利度胺是否抑制C6的增殖。2.使用细胞凋亡与坏死检测试剂盒（Apoptosis and Necrosis Assay Kit）测定各组不同浓度的Thalidomide（0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L）作用于C6细胞48h后的碘化丙啶（PI）阳性细胞率,计算细胞坏死率。3.实验对照组、Thalidomide（0μmol/L、50μg/m L、100μg/L、200μg/m L）处理C6细胞24 h后,收集肿瘤细胞提取总蛋白,Western blotting检测程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL、Caspase8,及凋亡相关蛋白Caspase3,血管生成主要因子VEGFA的表达情况。4.Nec-1抑制C6胶质瘤细胞RIP1蛋白的表达水平。使用沙利度胺诱导肿瘤细胞死亡,借此来研究程序性坏死关键通路RIP1/RIP3对沙利度胺治疗方案的影响。细胞贴壁后,进行药物处理,将细胞分为对照组、Thalidomide（0μg/m L、200μg/m L）及Thalidomide 200μg/ml+Nec-100μmol/m L组48h后分别测定各组PI+细胞数用来计算细胞坏死率。5、收集C6细胞2×10^6悬浮于100μL的PBS中,小鼠皮下注入后获得实体肿瘤,将建模成功的小鼠随机分成两组,肿瘤细胞接种7天后开始治疗,治疗计划如下:对照组给予吐温20灌胃,治疗组按沙利度按200mg/kg给药,用吐温20将Thalidomide配置成悬浊液灌胃。每天检测肿瘤生长情况,治疗7天后处死,测量肿瘤大小、重量,进行病理分析。结果:1.随着浓度升高,沙利度胺对鼠C6胶质瘤细胞的抑制效果逐渐增强。2.沙利度胺可显著增加鼠C6胶质瘤细胞的死亡,且细胞死亡可被Necrostatin-1下调。3.Western blot发现沙利度胺可使C6胶质瘤细胞程序性坏死PIP1/RIP3/MLKL通路中的RIP3、MLKL的表达明显升高,并抑制Caspase8的表达,同时Thalidomide可以使凋亡相关蛋白Caspase3的表达相对增强,抑制血管生成因子VEGFA的表达。4.抑制程序性坏死关键蛋白RIP1后,由沙利度胺诱导鼠C6胶质瘤细胞的程序性坏死通路的关键蛋白的表达受到明显的抑制。5.沙利度胺可通过激活鼠C6胶质瘤细胞中程序性坏死RIP1/RIP3/MLKL通路诱导细胞的程序性坏死,并同时诱导凋亡、抑制血管生成达到治疗效果。结论:1.Thalidomide具有抗鼠C6胶质瘤细胞作用。2.Thalidomide的抑制作用可能是由于Thalidomide激活了C6胶质瘤细胞中程序性坏死的RIP1/RIP3/MLKL通路,抑制Casepase8的表达,使细胞发生了程序性坏死,同时激活了凋亡通路,提高了细胞中Caspase3表达,多重因素作用下导致C6细胞的死亡。3.Thalidomide可以抑制鼠C6胶质瘤细胞的VEGFA的表达,在实体肿瘤的治疗中同样可能起到抑制肿瘤增殖的作用。4.Necrostatin-1可抑制程序性坏死通路,降低Thalidomide对肿瘤的杀伤作用。