目的：　　 [1]培养、鉴定和纯化E血清型沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)　　 [2]建立小鼠生殖道E血清Ct感染模型　　 [3]制备沙眼衣原体主要外膜蛋白(majoroutermembraneprotein,MOMP)MOMP168多表位，研究MOMP168多表位的免疫原性，包括体液免疫和细胞免疫；　　 [4]研究MOMP168多表位的对小鼠生殖道E血清Ct感染的免疫保护作用。　　 方法：　　 [1]将pET32a(+)/CtMOMP168重组质粒及pET32a(+)转化BL21菌株，通过IPTG诱导，并经Ni-NTA树脂亲和层析法纯化，制备CtMOMP168多表位和载体蛋白(Trx-his)，用于免疫原性和免疫保护作用研究；　　 [2]采用Hep-2细胞培养E血清型沙眼衣原体(Ct)并采用方法PCR，Giemsa、Lugol＇s碘染和间接免疫荧光进行Ct包涵体的鉴定以及采用反复冻融和超速离心的方法进行Ct纯化；　　 [3]小鼠生殖道E血清型Ct感染模型的建立：以106包涵体形成单位(Inclusionformingunits，IFU)剂量的Ct原体(Elementarybody,EB)感染BALB/c小鼠生殖道，同时Ct保存液(SPG)作为阴性对照。小鼠感染Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物CtPCR鉴定、病理切片等分析小鼠模型是否构建成功；　　 [4]选择6～8周BALB/c雌性小鼠，每组9只，用MOMP168多表位重组蛋白免疫。同时设置PBS、载体蛋白(Trx-his)、灭活沙眼衣原体对照组。采用0、2、4w皮下多点注射免疫，共免疫3次；隔周采集阴道分泌液和断尾取血分离血清，分别进行分泌液IgA和血清IgG、IgA、IgM、IgG1、IgG2a、Ig2b、IgG3的检测，并在末次免疫后取小鼠脾淋巴细胞检测其CTL(CytotoxcityTlymphocytes，CTL)的杀伤活性和Elisa检测血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的含量；　　 [5]于末次免疫后第2周用106IFU的E血清型Ct进行小鼠生殖道感染攻击。通过下列方法分析其免疫保护作用。1．通过观察小鼠生殖道炎症观察和评分并观察炎症的持续时间；2．通过ELISA检测小鼠生殖道特异性IgA抗体水平，及经断尾取血分离血清检测特异性IgG抗体水平；3.Ct攻击前后抗体水平比较，血清IgG抗体和阴道分泌物IgA；4．隔周采集阴道分泌物进行Ct分离和鉴定、并计数，以分析各组小鼠生殖道Ct清除率等；5.Ct攻击后4周，取小鼠生殖器官进行大体和病理切片观察，以分析Ct攻击产生的炎症情况。分析MOMP168多表位重组蛋白对小鼠生殖道感染E血清型Ct攻击的免疫保护作用。　　 结果：　　 [1]通过原核表达系统，分别获得纯化MOMP168多表位和载体蛋白(Trx-his)，蛋白表达量高达0.9mg/ml、0.6mg/ml。　　 [2]E血清型Ct经感染Hep-2细胞培养72h,培养细胞经Lugos碘液染色法、Giemsa染色法、间接免疫荧光等方法进行Ct包涵体鉴定，同时进行PCR检测Ct的DNA，结果证实Ct培养成功。并经反复冻融和超速离心的方法获得了纯化的E血清型Ct,其IFU值为1×108IFU/m1。为建立生殖道感染模型和检测Ct奠定了实验基础。　　 [3]MOMP168多表位免疫BALB/c小鼠后，采用ELISA方法检测生殖道分泌物及其血清中特异性抗体水平及其动态变化；采用LDH方法检测CTL的特异性杀伤及ELISA方法其血清内细胞因子水平。　　 体液免疫：ELISA结果显示MOMP168多表位免疫组能刺激机体产生较高抗灭活Ct全菌体的特异性血清IgG和生殖道粘膜IgA抗体水平。随着免疫次数的增加，抗体水平持续上升；血清抗体的类型以IgG1为主；在末次免疫后检测IgG抗体水平，MOMP168多表位组分别与载体组(Trx-his)、PBS组相比有均显著差异性(T1=12.587，p＜0.001；T2=20.818，p＜0.001)。在末次免疫后检测IgA的水平，MOMP168多表位免疫组与载体组、PBS组相比较：(T1=13.664,p＜0.001；T1=5.996，p=0.004)。灭活的Ct组IgA与MOMP168多表位免疫组相比较：(T=1.201，p=0.296)。　　 细胞免疫：末次免疫后1周，小鼠脾细胞经LDH检测CTL细胞杀伤活性，结果显示MOMP168多表位免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为35.85％±3.41％，与载体对照组9.09％±0.75％比较具有显著性差异(T=13.275，p＜0.001)。采用Elisa方法定量检测血清中细胞因子水平，结果显示，MOMP168多表位免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的IFN-γ和IL-4分别与载体组IFN-γ和IL-4相比较(T1=16.444，p＜0.001；T2=12.059，p＜0.001)有统计学意义。　　 [4]末次免疫后2周，各实验组经Ct生殖道攻击后，(1)通过观察小鼠生殖道炎症观察：感染后3天，各组小鼠出现不同程度的炎症表现，PBS组和载体组持续时间可达24天，MOMP168多表位组达18天；(2)生殖道分泌物Ct培养，隔周采集阴道分泌物进行Ct分离和鉴定、并计数，第5天时，MOMP168多表位和灭活Ct组IFU(1og10)为3.938±0.337、3.535±0.260与载体组4.206±0.141相比(T1=1.271，p=0.273；T2=3.910，p=0.017)。MOMP168多表位免疫组小鼠生殖道内的Ct于接种后第20天完全清除，而此时载体组，PBS组仍出现较为严重的Ct感染，两组小鼠生殖道内的Ct在接种Ct第25天后已完全清除；(3)通过ELISA检测小鼠生殖道粘膜特异性IgA抗体水平(A405读数)，灭活Ct组、MOMP168多表位组、载体组、PBS组分别与各组攻击前比较(T1=12.745,p＜0.001；T2=16.859,p＜0.001；T3=13.931,p＜0.001；T4=3.394,p=0.027)。分泌物中抗灭活Ct的IgA抗体水平持续升高3w，然后消退；经断尾取血分离血清检测特异性IgG抗体水平即A405读数，MOMP168多表位组与攻击前Ct组、MOMP168多表位组、载体组、PBS组比较(T1=12.208，p＜0.001；T2=118.45,p＜0.001；T3=16.432，p＜0.001；T4=18.900，p＜0.001)。各组血清中抗灭活Ct的IgG抗体水平持续9w未见消退；(4)通过ELISA检测Ct攻击后1w小鼠生殖道粘膜特异性IgA抗体水平即A405读数，MOMP168多表位组与载体组、PBS组比较(T1=31.435p＜0.001；T2=40.833，p＜0.001)；经断尾取血分离血清检测特异性IgG抗体水平即A405读数，MOMP168多表位组与载体组、PBS组比较(T1=49.692，p＜0.001；T2=82.318,p＜0.001)；(5)Ct攻击后4周，取小鼠生殖器官进行大体观察：PBS组和载体组小鼠输卵管壶腹部、峡部肿胀，而MOMP168多表位组和Ct组没发现明显的肿胀。病理切片：MOMP168多表位组和灭活Ct组的输卵管无明显变化，而载体组和空白组皱襞减少，管壁变薄。　　 结论：　　 [1]成功培养并纯化了E血清型Ct；　　 [2]建立了稳定的小鼠E血清型Ct生殖道感染模型；　　 [3]证实了MOMP168多表位具有具较强的免疫原性，可诱导小鼠产生血清特异性抗体，以IgG1亚类为主，及局部生殖道粘膜的IgA抗体，并能产生特异性的CTL反应；　　 [4]证实了MOMP168多表位组对小鼠生殖道Ct感染具有较强的免疫保护作用。