背景与目的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)起源于造血干细胞,病情凶险,病死率高,易复发。其发病率在中国为4.17/10万,死亡率位居肿瘤第七位,在儿童及35岁以下成人居第一位,是严重危害人类身体健康的恶性疾病之一。目前AML的治疗主要为化疗和异基因造血干细胞移植(Allogeneic stem cell transplantation, allo-SCT)。Allo-SCT是治愈AML的重要手段,它可使大部分患者完全治愈,但仍有约23%的患者最终复发死亡。此外,合适骨髓的配型、高昂的医疗费用、移植后排斥等间题均阻碍着患者行allo-SCT的选择,大部分患者最终只能选择化疗。虽然随着化疗方案的不断改进,患者的完全缓解率可达50%～75%,但是仍有15%～25%的患者因药物抵抗不能达到完全缓解,超过60%的患者最终复发死亡。Bonnet等研究发现白血病难治复发的根源是白血病干细胞(Leukemia stem cells, LSCs)。他们首次从AML患者骨髓中分离出CD34+CD38-和CD34+CD38+两组免疫表型的白血病细胞亚群,并将这两组细胞分别从尾静脉移植给非肥胖型糖尿病／重度联合缺陷小鼠伴NK细胞缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,发现只有移植CD34+CD38-亚群的小鼠能够克隆白血病,并且白血病细胞的形态和功能状态和病人一致,证实了LSCs的存在。LSCs起源于正常造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs),具有HSCs样自我更新复制功能。研究显示95%的LSCs处于GO期,而常规的化疗药物仅能杀死增殖期的白血病细胞,对静止状态下的LSCs缺乏杀伤作用,使LSCs得以逃避杀伤,最终导致白血病复发,LSCs的存在是白血病复发的根源。早期我们的研究也发现将高表达CD34+CD38-表型的KGla细胞移植入NOD/SCID小鼠体内,可成功克隆出白血病动物模型,因此如何彻底杀灭LSCs是治愈AML的关键。自然杀伤细胞(Nature Killer cell, NK细胞)是人体重要的天然免疫细胞,具有广谱抗肿瘤、抗感染、免疫调节等作用。它是人体免疫系统的第一道防线,不需预先致敏,无MHC限制性,可白发地杀伤MHC-1类分子缺陷或低表达的肿瘤细胞,它也是骨髓移植后最先植入的淋巴细胞(在骨髓移植后前三个月,占人体外周血淋巴细胞70%以上),在杀灭白血病干细胞中发挥着至关重要的作用。然而多项研究发现,肿瘤细胞表面NKG2D配体,如MICA/MICB、 ULBP1、ULBP2、ULBP3等表达均明显降低,甚至低于无法检测,增强NKG2D配体的表达可增强NK细胞的杀伤作用,前期我们的研究也发现AML患者白血病细胞表面NKG2D配体MICA/MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达亦降低,如何增强LSCs细胞表面NKG2D配体的表达为治愈AML指明新的方向。地西他滨(decitabine,5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸)是一种天然的脱氧胞苷酸的腺苷类似物,可替代肿瘤内的胞嘧啶与DNA甲基化转移酶共价结合,使DNA甲基化转移酶失活,达到去甲基化的作用,从而抑制增殖、促进肿瘤细胞的凋亡。另外一方面,DNA的去甲基化作用还可抑制肿瘤细胞表面杀伤抑制性受体(Killer inhibitory receptor,KIR)的合成,使肿瘤细胞表面杀伤活化性受体(killer cell activatory receptor,KAR)失去KIR的抑制作用,增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,共同发挥抗肿瘤的作用。此外,有研究还发现,地西他滨具有免疫调节作用,可提高肿瘤细胞表面的NKG2D配体MICA/MICB、ULBP等的表达,提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。由此我们设想地西他滨能否通过增强LSCs表面NKG2D配体的表达来增强allo-NK细胞对LSCs的杀伤作用呢?本课题在前期研究的基础上,以CD34+CD38-LSCs为研究对象,探讨地西他滨的免疫调节作用,为治疗AML提供理论基础及实验依据。方法第一章从KGla细胞株分选LSCs采用免疫磁珠分选方法从KGla细胞株分选CD34+CD38-细胞；流式细胞术检测分选细胞的CD34+CD38-LSCs的纯度。第二章地西他滨增强NK细胞系对LSCs的杀伤作用1)淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞,Human rIL-2、Human rIL-15诱导NK细胞形成；CCK-8实验方法检测不同浓度地西他滨对LSCs的细胞毒性；LDH法检测NK细胞系(NK-92细胞及NK细胞)对K562细胞及干预前后的LSCs在不同效靶比的杀伤作用；流式细胞术检测NK细胞系对K562细胞及干预前后的LSCs在效靶比为10：1时的杀伤作用；2)运用SPSS 20.0软件进行数据分析,数值以均数±标准差(X±s)表示。不同效靶比间NK细胞系的杀伤活性比较采用析因设计方差分析；方差齐时,组间多重比较采用LSD法,方差不齐时,组间多重比较采用Dunnertt T3法；P<0.05为差异有统计学意义。第三章地西他滨增强NK细胞杀伤LSCs的机制1)流式细胞术检测K562细胞、干预前后LSCs表面NKG2D配体(MICA/B、 ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达；Western-blot检测地西他滨对LSCs线粒体凋亡途径相关蛋白的影响；2)运用SPSS 20.0软件进行数据分析,数值以均数±标准差(X±s)表示。K562细胞与未干预组LSCs细胞表面NKG2D配体表达、地西他滨干预前后LSCs细胞表面NKG2D配体表达、干预前后凋亡相关蛋白表达均采用独立样本t检验；P<0.05为差异有统计学意义。结果第一章从KGla细胞株分选LSCs采用免疫磁珠分选技术从KGla细胞株成功分选出CD34+CD38-型LSCs;流式细胞术检测分选出的LSCs CD34+CD38-抗原的表达高达99.95%。第二章地西他滨增强NK细胞系对LSCs的杀伤作用1)NK细胞形态健康志愿者外周血分离出的PBMC体积较小,细胞圆亮,经Human rIL-2、 Human rIL-15诱导刺激的第二天即开始分裂增殖,细胞生长较快,镜下观察NK细胞体积较小,圆形透亮,呈团簇状生长。2) LSCs对地西他滨的杀伤敏感性CCK-8细胞毒性结果显示,药物浓度在(0-60 uM)的地西他滨干预LSCs 24h后,LSCs的活性依然大于60%,表明地西他滨对LSCs的杀伤作用不敏感,LSCs对地西他滨抵抗。3)NK细胞系的杀伤活性LDH法检测结果显示,NK细胞系对K562细胞杀伤作用敏感。在效靶比为5：1、10：1、20：1时,NK-92细胞株对K562细胞的杀伤率分别为46.00±3.73%、53.58±3.10%、66.51±1.70%,远高于相同效靶比下对LSCs的杀伤率(24.13±1.26%、27.88±2.04%、34.92±4.22%),不同效靶比间两组细胞的被杀伤率比较差异有统计学意义(F=4.327,P=0.038)；NK细胞在效靶比为5：1、10：1、20：1时对K562细胞的杀伤率为44.38±2.81%、64.77±3.66%、73.91±3.54%,对LSCs的杀伤率为22.08±2.07%、28.99±3.13%、36.44±2.40%,两组细胞不同效靶比间的被杀伤率比较差异亦有统计学意义(F=11.588,P＝0.002),以上提示K562细胞对NK细胞系敏感,LSCs对NK细胞系抵抗。而10umol/L地西他滨干预LSCs后,NK细胞系对LSCs的杀伤作用明显增强,在效靶比为5：1、10：1、20：1时,NK-92细胞对干预后的LSCs的杀伤率分别为40.29±1.72%、55.47±1.86%、66.91±2.08%,均高于相同效靶比下对未干预组LSCs的杀伤率,两组细胞的被杀伤率差异有统计学意义(F=13.845, P=0.001); NK细胞对干预后的LSCs的杀伤率为60.52±3.52%、73.93±2.33%、83.08±1.32%,亦高于同一效靶比下NK细胞对未干预组LSCs细胞的杀伤作用,不同效靶比下两组细胞的被杀伤率差异有统计学意义(F=4.276,P=0.04)。流式细胞术检测结果显示,在效靶比为10：1时,NK-92细胞、NK细胞对K562细胞的杀伤率分别为7.33±1.08%、14.65+1.98%,均高于未干预组LSCs的2.43+0.60%、3.33+0.64%,此结果与LDH实验结果一致,二者组间差异比较有统计学意义(t=6.863, P=0.002; t=9.446, P=0.001)。10umol/L地西他滨干预LSCs后,NK-92细胞、NK细胞对干预后的LSCs的杀伤率分别为7.85+0.88%、7.84+0.34%,亦高于各自相对应的未干预组(2.43+0.60%,3.33±0.64%),二者组间比较差异均有统计学意义(t=8.864,P=0.001, t=10.821, P=0.000)。第三章地西他滨增强NK细胞杀伤LSCs的机制1)K562细胞及干预前后LSCs表面NKG2D配体的表达流式细胞术检测结果显示对NK细胞系敏感的K562细胞表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达分别为2.45±0.92%、16.85±1.78%、1.94+0.90%、4.73+0.58%,均高于LSCs表面NKG2D配体的表达(0.17±0.07%、0.28±0.10%、1.244±0.12%、0.48±±0.08%),二者组间比较差异有统计学意义(P<0.05);10 umol/L地西他滨干预LSCs后,LSCs表面NKG2D配体的表达增加,分别为2.88±±0.10%、1.26±0.35%、2.16±0.34%、3.37+0.82%,、二者组间比较差异有统计学意义(P<0.05),表明地西他滨可增强LSCs表面NKG2D配体的表达。2)地西他滨对LSCs线粒体凋亡途径相关蛋白的影响Western-blot检测法结果显示,与未干预组相比,地西他滨可促进LSCs线粒体凋亡途径caspase-9、caspase-3、 PARP的活化,下调Bcl-2抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达,而对促凋亡蛋白Bax无影响。结论1)KGla细胞株富含CD34+CD38-LSCs,可通过免疫磁珠分选技术从中成功分选出纯度极高的LSCs用于后续相关研究；2) LSCs对地西他滨抵抗；3) LSCs对NK细胞系(NK-92细胞及NK细胞)抵抗,地西他滨可增强NK细胞系对LSCs的杀伤作用；4)地西他滨可通过上调LSCs表面NKG2D配体的表达增强NK细胞系对LSCs的杀伤作用；5)地西他滨可能通过线粒体凋亡通路上调NKG2D配体的表达。