铝是地壳中最丰富的金属元素,同时也是土壤无机矿物的主要元素。当土壤pH<5.0时,固定态的铝就转变为溶解的Al3+离子状态,微摩尔水平的Al3+在几分钟内即可对植物造成毒害,而且pH越低,铝的溶解性越大,对植物造成的毒害也越大。铝毒害诱导脂质氧化物及过氧化物产物生成,影响细胞间物质运输,破坏根尖细胞的正常伸长和发育,进而抑制主根和侧根伸长。因此,铝毒害已成为影响作物产量的限制因素之一。大豆(Glycine max(L.)Merr.)是一种重要的经济作物,为人类提供优质蛋白和油脂。然而南方酸性土壤的铝毒害严重影响了大豆的产量。目前关于大豆耐铝毒基因及其耐铝毒机制的报道非常有限。因此,挖掘大豆中优异的耐铝基因并鉴定其功能,探索大豆耐铝毒的分子调控网络,将为大豆分子育种提供重要的基因资源和理论依据。本研究采用前期鉴定的耐铝(KF)和感铝(GF)两个大豆品种为材料,通过芯片技术和生物信息学分析,鉴定了参与大豆耐铝毒相关的代谢通路及关键候选基因。利用qRT-PCR技术对关键耐铝毒候选基因的大豆九个组织中的表达情况,结果表明这些基因在不同的亚家族中的组织表达模式差别转录水平进行了验证,结合植物转基因技术及生理和表型测定,研究耐铝候选基因在铝毒胁迫下的功能。本文所获得研究结果如下:1.铝毒胁迫对大豆耐感铝品种的影响对幼苗期鉴定的耐铝品种KF和感铝品种GF进行铝处理,研究铝毒对大豆生物量及生理指标的影响。铝处理浓度随处理天数的推移呈梯度增加,达到20mM时,感铝品种GF的生物量(根部干重,地上部干重,株高等)受到显著抑制;生理指标如抗氧化物酶类(POD(Peroxidase)、SOD(Superoxide Dismutase)、CAT(Catalase)等)的含量在两个品种中均增加,但耐铝品种比感铝品种增加更显著;而细胞膜丙二醛(MDA)在感铝品种中显著增加。结果表明当铝浓度超过一定范围时,铝毒害会严重抑制感铝品种的生长,破坏生理调节,而耐铝品种会通过生理指标如POD、SOD、CAT等的调节来抵抗外界的胁迫,从而维持自身相对正常生长。2.耐感铭大豆品种在铝毒胁迫下的基因表达谱分析利用包含66473个大豆探针的Affymetrix的mRNA表达谱芯片对耐铝品种KF和铝敏感品种GF在对照(0μM AlCl3,pH=4.3)和铝处理(25μM AlCl3,pH=4.3)6、12和24小时后的根尖进行表达谱分析。根据“FDR(False Discovery Rate)≤0.05和|log2 FC(Fold Change)|≥1”两个阈值鉴定差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEG)。在铝处理6h后,耐、感品种DEGs的个数分别为1210和1394个,铝处理12h后耐感品种DEG个数分别为1846个和2916个,铝处理24h后,耐感品种DEGs的个数明显增加,分别为3741和6633个。用MAPMAN对24h的的DEGs进行代谢通路分析,发现铝胁迫下,参与糖酵解、三羧酸循环及GABA循环等代谢通路的基因表达在两个品种间有显著差异。进一步对这些DEGs进行筛选,发现1937个基因在耐铝品种比感铝品种显著上调。AgriGO网站分析发现这1937个基因中参与抗氧化物酶代谢的POD基因显著富集,且这些POD基因在耐铝品种中受铝毒诱导显著上调,但在感铝品种中下调表达或上调不显著。1937个基因的GO注释显示分布到38个功能类别中,主要包括细胞外区域、抗氧化剂、酶催化活性、转运体、代谢过程和刺激应答等功能类别。这1937个基因进行转录因子富集分析,发现WRKY,MYB,AP2等转录因子显著富集。通过qRT-PCR对15个基因进行表达分析,与芯片结果相关性为R2=0.766,表明两种方法比较一致。基于差异表达谱分析和生理指标(POD活性等)测定结果并结合相关文献报道,推测大豆耐铝性差异可能与一些关键代谢途径、抗氧化物酶、转录因子、有机酸分泌等相关,这些基因可作为重点耐铝候选基因进一步研究。3.多药及毒性化合物外排转运MATE的全基因组鉴定和生物信息学分析多药及毒性化合物外排转运(Multidrug and toxic compound extrusion,MATE)蛋白家族是多药排出转运体的重要成员,主要参与转运有机酸、植物激素、次级代谢物等有机化合物。然而,目前关于植物尤其是大豆MATE家族还鲜有报道。以MATE保守结构域的序列为条件,通过HMMER检索,同时以拟南芥中MATE基因的蛋白序列为参考序列,在Phytozome数据库中进行BlastP比对,发现大豆中共有117个MATE基因,根据其物理位置分别命名为GmMATE1-GmMATE117,分布在20条染色体上。进化分析显示大豆MATE基因分为4个亚家族10个小亚族,这与前人的研究结果一致。利用qRT-PCR技术研究MA TE家族在大豆九个组织中的表达情况,结果表明这些基因在不同的亚家族中的组织表达模式差别很大。通过进化树分析和亚家族内已知功能的基因,推测亚族4中的第三个小亚组(C4-3)的8个GmMATE基因可能编码铝离子转运体。在PlantCARE数据库中对这8个基因上游启动子1500bp的序列进行顺式作用元件预测,发现有1 1个与胁迫相关的元件,包括激素响应ABRE(ABA-responsive element)、TCA-element,逆境响应ARE(响应厌氧元件)、HSE(热激响应元件)、LTR(低温响应元件)、WUN(创伤响应激元件),及其他的CGTCA-motif、MBS(MYB binding site)、TC rich-repeats、TGACG-motif、W1-Box。此外,对耐铝毒相关转录因子ART1的DNA-Binding序列(GGNVS)进行了预测,发现这8个GmMATE基因都含有5个以上的GGNVS序列,说明这些基因有被耐铝转录因子ART1调控的可能性。检测这8个GmMATE基因在铝胁迫下的表达模式发现,GmMA TE75在耐铝大豆品种受到铝毒胁迫6、12、24h时显著上调表达。4.大豆耐铝相关基因MATE的功能研究利用转基因拟南芥和大豆发状根对GmMATE75基因功能进行研究,结果显示在25μM的铝处理下,过表达GmMA TE75基因的拟南芥根尖铝离子含量比突变体M(AtMATE-KD)和野生型(Col-0)的明显减少;主根、侧根及叶片受铝毒抑制的程度明显降低;同时根尖活性氧的含量明显减少,说明过表达GmMA TE75提高了转基因拟南芥的耐铝性。与转空载的大豆发根相比,过表达GmMA TE75基因的大豆阳性发根在铝处理后根尖铝离子含量减少,说明过表达GmMA TE75提高了大豆的耐铝性。