论文部分内容阅读
H5亚型禽流感(Avian influenza,AI)在我国已流行多年,是导致禽类高发病率和高死亡率的主要禽病之一。由于免疫选择压的存在,H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的进化变得更为复杂,各分支之间的抗原差异较大,疫苗的升级周期也越来越短。DIVA(Differentiate infected from vaccinated animals)疫苗可用于区分自然感染和疫苗免疫的动物,使用后有利于H5亚型AIV的流行病学调查和净化检测。但是,常见的DIVA策略由于病毒重组、免疫原性不佳等原因鲜少能够投入实际运用。HA蛋白是位于AIV囊膜上的糖蛋白,能够诱导机体产生具有保护性的中和抗体。相较于HA1蛋白,HA2蛋白的保守性更佳,逐渐成为AIV通用型抗原表位研究中的主要靶蛋白。而多肽芯片凭借高通量、稳定性好和检测灵敏度高等特点,在临床检测、医药研发等领域都得到了较好应用。因此,基于多肽芯片技术的H5亚型AIV HA2蛋白抗原表位筛选有望为H5亚型AIV的DIVA疫苗设计提供新方向。1.基于多肽芯片技术的H5亚型禽流感病毒HA2蛋白抗原表位筛选以H5亚型AIV分离株A/Mallard/Huadong/S/2005为母本,合成了 18条针对HA2蛋白长度为20个氨基酸且互相重叠10个氨基酸的肽段,将其点样至改性硅胶膜(iPDMS)制成多肽芯片,首先确定多肽与免疫血清结合的反应条件,再测定多肽与不同亚型AIV高免血清之间的结合能力,初步筛选到一条能够与H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10亚型AIV高免血清均能结合的多肽(14th肽,KELGNGCFEFYHKCDNECME)以及两条仅与H5亚型AIV免疫血清结合的特异性多肽(12th 肽,HDSNVKNLYDKVRLQLRDNA;17th 肽,QYSEEARLKREEISGVKLES)。2.基于HA2蛋白的禽流感病毒共同抗原表位的鉴定对14th肽的广谱性特征开展了进一步的鉴定。将14th肽进一步细切为4条长度为11个氨基酸且互相重叠8个氨基酸的短肽(14-1,KELGNGCFEFY;14-2,GNGCFEFYHKC;14-3,CFEFYHKCDNE;14-4,FYHKCDNECME),测定其与不同亚型AIV免疫血清的结合能力。结果显示,14-4肽(485-FYHKCDNECME-495)具备与H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10亚型AIV免疫血清广谱结合活性,而14-1、14-2和14-3肽仅与个别血清有阳性响应。进一步对14-4肽的关键氨基酸“YHKCD”设计了 16种缺失/突变模式,通过反向遗传技术拯救病毒,应用Western-blot分析重组病毒与14th肽偶联BSA的免疫血清反应。结果显示,成功拯救重组病毒S-Y-G、S-H-G、S-K-G和S-D-G,氨基酸(K或D)的突变会降低重组病毒HA2蛋白与肽免疫血清的结合能力。通过免疫表位数据库(Immune epitope database,IEDB)的表位分析显示,该肽段包含MHC-II限制性的T细胞表位,部分实验表明其能够影响IL-2和IFNg的释放。以上所有结果表明,该14-4肽含有多个亚型禽流感病毒的广谱性表位,具有开发为通用型AIV诊断靶标的潜能。3.基于H5亚型禽流感病毒HA2蛋白特异性抗原表位的DIVA疫苗候选株构建挑选了 6株来自不同谱系、效价稳定的H5亚型AIVCK/JS/ZJ0104/16(2.3.2.1e,ZJC)、CK/JS/DT0303/16(2.3.2.1e,DTC)、GS/JS/HJ0105/16(2.3.4.4c,HJG)、GS/JS/YZ1111/16(2.3.4.4d,YZG)、GS/GD/GD0531/17(2.3.4.4d,GDG)和CK/JS/YZ1111/16(2.3.4.4e,YZC),制备高免血清进行交叉血凝抑制试验筛选疫苗候选株。同时,基于前期所筛选的H5亚型AIV特异性表位12th肽(HDSNVKNLYDKVRLQLRDNA)和 17th 肽(QYSEEARLKREEISGVKLES),用H1和H3亚型AIV相应表位替换这两个表位构建重组病毒。结果显示DTC的高免血清对ZJ0104、DTC、HJG和GDG的HI效价均可达到7 log2以上,对YZG和YZC的HI效价分别为4 1og2和2 1og2。相较而言,DTC毒株的广谱性更好,可作为H5亚型AIV疫苗候选株。通过替换相应的表位成功拯救了 DTC-Lo-121、DTC-Lo-171、DTC-Lo-173、DTC-Lo-121171 和 DTC-Lo-121173。运用多肽芯片进一步评估发现,单表位替换株DTC-Lo-121免疫血清对12th肽和17th肽均有阳性响应,DTC-Lo-171和DTC-Lo-173的免疫血清则对12th肽和17th肽的响应均小于检测线,双表位替换株DTC-Lo-121171的免疫血清仅对17th肽失去响应,DTC-Lo-121173免疫血清仅与12th肽无响应。以上结果表明通过17th肽的替换,重组病毒DTC-Lo-171和DTC-Lo-173具有较好的DIVA特性,可作为H5亚型禽流感防控的DIVA疫苗候选株,为进一步开发H5亚型AIV DIVA疫苗奠定基础。