马铃薯块茎休眠相关StTCP15基因表达分析及其表达载体构建

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhh6622692
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TCP(Teosinte branched 1,Cycloidea,Proliferating cell factor)转录因子是植物特有的转录因子。TCP在植物生长发育、昼夜节律、激素信号转导以及抗逆应答反应中具有重要作用。本实验室前期工作中,对马铃薯(Solanum tuberosum L.)TCP基因家族进行鉴定分析,发现马铃薯StTCP15基因受到细胞分裂素、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)的诱导表达,并在块茎休眠打破过程中StTCP15基因表达量变化显著。为阐明StTCP15基因在马铃薯块茎休眠中的作用,本研究通过生物信息学方法分析了StTCP15转录因子的蛋白结构、互作蛋白、系统进化树和基因表达量;通过外源激素GA3、ABA和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)及变温分别处理马铃薯块茎,测定并分析了马铃薯块茎休眠打破过程中内源激素GA3、ABA、6-BA和吲哚乙酸(IAA)含量以及StTCP15基因的表达水平;用同源重组方法构建了StTCP15基因的过表达载体和亚细胞定位表达载体,人工mi RNA技术构建了StTCP15基因的干扰表达载体。取得的主要研究结果如下:1.马铃薯StTCP15基因CDS区为1245 bp,含有2个外显子1个内含子,编码414个氨基酸,其蛋白质为中性的亲水蛋白。对StTCP15基因顺式作用元件进行分析,结果表明该基因启动子区含有响应ABA、生长素等激素和响应冷胁迫等非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。分析马铃薯数据库中的测序结果表明StTCP15基因具有组织表达特异性,在叶柄中表达量最高,茎和芽中的表达次之。在不同生物胁迫和非生物胁迫处理下,StTCP15基因均有明显变化,其中在机械损伤、ABA处理以及35℃热处理下表达量变化明显。2.外源激素GA3、ABA、6-BA和变温处理马铃薯块茎,发现变温处理和GA3处理下块茎发芽率较高,ABA处理发芽率最低。3.利用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)测定外源激素GA3、ABA、6-BA和变温处理下不同时期马铃薯块茎中内源激素GA3、ABA、6-BA和IAA的含量。结果表明随着贮藏时间的延长马铃薯块茎中ABA、GA3和IAA含量升高;块茎休眠打破时ABA含量降低,GA3和6-BA含量升高;块茎发芽期间4种内源激素GA3、ABA、6-BA和IAA含量均升高。4.qRT-PCR分析结果表明外源激素GA3、ABA和6-BA处理条件下,StTCP15基因在块茎休眠过程中表达量持续升高,而在块茎休眠解除后表达量降低。外源激素GA3、ABA和6-BA处理条件下StTCP15基因的表达量与内源ABA的含量变化趋势一致,且StTCP15基因响应外源6-BA处理。低温处理条件下StTCP15基因的相对表达量上调9倍,恢复室温后StTCP15基因的表达量也恢复到正常水平,这表明StTCP15基因响应低温处理。5.利用PCR技术扩增马铃薯StTCP15基因,采用同源重组方法构建了StTCP15基因的亚细胞定位载体p CEGFP-StTCP15和Ca MV 35S启动子驱动的过表达载体p BI121-StTCP15;通过人工mi RNA技术构建了StTCP15基因的干扰表达载体p CPB121-ami R-StTCP15,并将3个构建好的载体导入农杆菌感受态细胞,为后续进行StTCP15基因的亚细胞定位实验和基因功能研究奠定了基础。
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