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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪发生繁殖障碍和仔猪出现呼吸道症状为特征的传染性疾病。根据基因型差异，PRRSV可分为北美洲型(VR-2332为代表株)和欧洲型(LV为代表株)。因PRRSV侵害免疫系统而且易发生变异，常规的疫苗策略难以产生理想的效果，所以，研制安全而有效的基因工程疫苗具有重要的意义。 根据PRRSV结构蛋白各自在诱导猪体产生免疫应答中的特性，以真核表达质粒pIRES1neo(CLONTECH)为骨架，设计构建了一系列针对PRRSV的双基因表达载体：pIRESorf5/4(含有PRRSV ORF4和ORF5)、pIRESorf6/5(含有PRRSV ORF5和ORF6)、pIRESorf7/5(含有PRRSV ORF5和ORF7)，并构建了含有猪细胞因子编码基因的重组质粒pIRESorf5/IFN_γ(含有PRRSV ORF5和猪IFN_γ基因)、pIRESorf7/IFN_γ(含有PRRSV ORF7和猪IFN_γ基因)、pIRESorf5/IL-2(含有PRRSV ORF5和猪IL-2基因)和pIRESorf7/IL-2(含有PRRSV ORF7和猪IL-2基因)。 经IIF检测和小鼠预试验，确证了这些重组质粒可以表达。将30头PRRSV阴性小猪分为10组，其中一组作为空白对照，其余组分别接种重组质粒pIRESorf5/4、pIRESorf6/5、pIRESort7/5、pIRESorf5/IFN_γ、pIRESorf7/IFN_γ、pIRESorf5/IL-2、pIRESorf7/IL-2、灭活苗和空质粒pIRES1neo。我们以PRRSV CH-1a株主要结构基因ORF4、tORF5(truncated ORF5)、ORF6和ORF7的原核表达产物rGP4、rtGP5、rM和rN蛋白作为抗原，对接种动物进行了血清学检测。经过两次免疫后，大部分带有PRRSV ORF7的重组质粒都诱导猪体产生了针对PRRSV N蛋白的ELISA抗体和Western Blotting抗体。而带有PRRSV ORF4、ORF5或ORF6的重组质粒诱导猪体产生抗体的速度较慢，ELISA抗体滴度较低，有的动物在4次免疫后都没有检测到博士学位论文 中文拘要 中国农科院研究生院ELrsA抗体。但是经4次免疫后，全部检测到了 Western Blotting抗体。在检测中，所有 ELISA抗体阳性的动物在 Western Blotting检狈中都呈阳性，W且 Western BI0tting抗体的出现要早于EL旧A抗体。 PRRSV的感染一般为亚临床表现，在本试验中，攻毒后所有的小猪都没有出现呼吸困难、耳朵发兰等症状，但空白对照猪和空质粒接种猪的体温要高于基因疫苗免疫猪和灭活苗免疫猪，最高可达 40石 C。 在对外周血淋巴细胞中n4＋、CDS＋及CD4VCDS＋了细胞亚类的动态监测中，实验动物表现出极大的差异。与空白对照组和空质粒p旧ESineo免疫组比较，各重组质粒免疫组动物的CD4＋、C08＋及CD4＋IC08＋T细胞有不同程度的升高。攻毒后 ＊旧ESOrfsl4＊旧ESOrf6／5、p旧ES0rf715、p旧ESOrf7llFNY、pIRES0rfsllLZ和p旧ES100O免疫组动物均呈现为cD个丁细胞含量稳步上升，而卯8＋了细胞含量一过性上升后很快就下降，这和文献报道的不同。 尽管攻毒后动物没有表现出明显的呼吸道症状，但在剖检后发现在肺脏有不同程度的病理变化，主要表现为粉红色肉样变和灰色肝样变，显微镜下观察表现为！白］质性肺炎和小叶性肺炎病变。空白对照组动物病变严重。在疫苗接种组中，p旧ES0rfsllFNY免疫组中有2头猪（213），p旧ESOrfsl儿－2免疫组（113）、p旧ES。rf71几－2 （1／3）兔疫组和灭活苗免疫组（112）中各有 1头猪肺脏完全正常，没有病变。 在对实验动物主要脏器中病毒粒子含量的检测中发现，基因疫苗和灭活苗都没能阻止PRRSV病毒血症的发生尸RRSV病毒粒子在大多数动物脏器中都有分布。但病毒粒子在不同动物、在动物不同脏器中的含量却差异较大。与对照组相比，基因疫苗在一定程度上抑制了病毒的复制。 综合各项指标，这些基因疫苗都能诱导机体产生抗PRRSV的抗体，在抗病毒免疫中能够发挥一定的作用，但与常规疫苗一样，并不能高效杀灭病毒粒子，阻止病毒血症的发生。而且不同的基因疫苗在诱导机体免疫应答、在机体的抗病毒作用中表现出不同的效能。基困疫苗中的细胞因子在抗病毒免疫、保护机体兔受入侵病毒的损害中发挥了重要作用。 本试验对 PRRSV主要结构基因在抗 PRRSV免疫应答中的作用进行了研究，并检测了细胞因子在免疫应答中的增强作用。这些数据将为今后PRRSV疫茵，特别是基因工程疫苗的研制提供借鉴。 PRRSV嗜好在PAM和其他单核细胞上生长，如果把PRRSV作为一种病毒活 2薛强 猜鳖殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建及其免疫效力评价2003年6月载体，它就可以携带外源抗原高效进入猪体的兔疫系统，更好地刺激机体产生免疫应答。而作为病毒活载体，必须是弱毒，而且能够进行体外操作。PRRSV为RNA病毒，在体外难于进行基因操作。运用反向遗传操作技术，将基因组RNA转换为CDNA，在DNA水平上就易于对病毒进行基因操作。感染性分子克隆是RNA病毒反向遗传操作的技术平台。 根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性酶切位点，将PRRSV基因组分为8段进行?