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以等质量比的不同发育阶段的麻疯树(Jatropha curcas L.)胚乳为材料,提取纯化mRNA,使用Stratagene公司生产的cDNASynthesis Kit、Gigapack IIIGold Packaging Extract,用Uni-ZAP XR载体构建麻疯树胚乳cDNA文库。初级文库滴度为1.5x10<6>Pfu/ml,扩增文库的滴度为1.Oxl0<14>pfu/mL,重组率约为99.7[%],插入片段大小范围经PCR及测序检测为0.4kb~4kb,平均约1kb。随机挑取10个cDNA插入片段进行测序,利用生物信息学方法,与其它生物已知的基因或蛋白质序列做全长性与同源性比较分析,结果表明文库中的cDNA插入片段的完整性较好,全长基因的比例达到20[%],可以用于全长基因的筛选。根据测得cDNA序列推测出的蛋白质序列种类主要包括贮存蛋白相关、转录表达调控相关、脂肪酸合成相关及信号传导相关等同源基因序列,具体有金属硫因蛋白、翻泽延长囚子、MADS一Box等基因的类似物。参与贮存蛋白相关基因的比例是20[%],转录因子相关基因的比例是6[%],脂肪酸合成代谢的比例是4[%],信号传导相关基因的比例是12[%],氨基酸代谢相关基因的比例是2[%]。编码功能基因的类型与分布情况同JosephA.White等构建的蓖麻胚乳cDNA文库中的基因的类型与分布情况基本一致,个别类犁如贮存蛋白合成相关基因的比例相比较低,信号传导与转录引子相关基因的比例较高。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase,EC 4.1.1.31)是一种CO<,2>固定酶,它催化从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和碳酸氢酐(CA)生成草酰乙酸(OAA)的反应,在能量和I生物合成代谢中主要发挥多种作用。麻疯树PEPC:基因的克隆从双子叶植物与单子叶植物中同源性高的PEPC基因的序列比较分析开始,
根据大戟科大戟属绿玉树(Euphorbia tirucalli L.)、锦葵科陆地棉(Gossypiumhirsutum L.)、豆科紫苜蓿(Medicago sativa L)以及玉蜀黍属玉米(Zea mays)(C3型)的PEPC基因的核甘酸序列和氨基酸序列,设计4条简并引物,通过梯度PCR寻找合适的退火温度,得到与预期长度相符合的扩增产物,其中200bp长的产物克隆到pMlD-18 T载体,序列测定和同源性比对分析,结果显示这一200bp长的片段是麻疯树PEPC基因的一部分。
麻疯树PEPC基因的克隆对于麻疯树PEPC基因的研究和应用具有重要意义,有助于了解麻疯树的光合作用机制,为提高麻疯树种子中脂肪酸产量提供理论和技术支持。