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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病。猪是PRV重要的原发宿主,各种年龄猪均可感染发病。自2011年以来,PRV流行毒株的毒力明显增强,疾病流行范围扩大,经典疫苗毒株接种后免疫保护效果不够理想,猪只发病后的死亡率显著提高,给我国养猪业造成了巨大经济损失。因此,摸清现地流行毒株特性,寻求免疫原性好的疫苗候选毒株对科学防治本病具有重要意义。本研究采集黑龙江五常、黑河、大庆、绥化等部分地区经伪狂犬病疫苗免疫后疑似猪伪狂犬病发病猪的病料,对其进行病毒分离和鉴定。取病死仔猪脑组织经细胞分离培养、电镜形态学鉴定、免疫荧光分析、PCR鉴定和核酸序列测定,共分离到4株PRV毒株,分别命名为PRV-WC01、PRV-HH01、PRV-DQ01和PRV-SH01。对分离毒株的g C、gE基因序列进行了遗传变异分析,结果显示所分离获得的4株PRV与近几年报道的PRV流行毒株同源性较高,处于同一个分支中,而与经典株PRV同源性较低,处于不同的分支中;毒力实验测定结果显示,PRV-WC01株对56日龄仔猪的LD50为10-3.17/mL;将病毒含量为108.50TCID50/mL的PRV-WC01株病毒液经0.1%甲醛灭活,加入MONTANIDETM ISA201 VG佐剂制备免疫原,接种21日龄仔猪。经过2次免疫,在2免后21d用PRV WC01株以10×LD50/头的剂量进行攻毒。免疫保护率为100%,表明该毒株作为免疫原,具有较好的免疫原性,对流行毒株具有完全的免疫保护作用。以PRV-WC01为亲本毒株,根据PRV Bartha-K61株的基因缺失位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了PRV gI和gE双基因缺失突变体。通过病毒蚀斑计数和荧光定量PCR针对PRV各基因的sg RNA编辑效率筛选,以获得高效基因编辑的sg RNA。针对PRV基因组中的gE基因和gI基因,分别设计了多个sg RNA,通过病毒蚀斑计数方法,筛选出了针对gE基因和gI基因编辑的sg RNA。为了提高Cas9基因在细胞中表达量以获得更高的基因敲除效率,通过慢病毒系统构建了稳定敲除PRV gE和gI双基因的Vero细胞株。首先通过酶切连接和同源重组,获得了慢病毒转移质粒Lenti CRISPR V2-sg RNA gE/gI。将质粒转染Vero细胞,以PRV-WC01感染转染细胞,经18h收集病毒液,提取病毒核酸,测序鉴定已构建质粒的基因编辑功能。随后通过慢病毒三质粒系统共转染293T细胞包装慢病毒,三质粒包括转移质粒Lenti CRISPR V2-sg RNA gE/gI,包装质粒p MD2.G以及表达Gagpol蛋白的辅助质粒ps PAX2。完成包装的慢病毒采用PEG慢病毒纯化试剂进行纯化浓缩,然后感染Vero细胞,用嘌呤霉素加压筛选获得稳定敲除gE和gI基因的细胞系。通过PCR扩增和Western blot验证获得的细胞系基因组中整合了CRISPR/Cas9系统并能正常表达Cas9蛋白,构建获得了包含gE和gI的两个高效sg RNA以及表达Cas9蛋白的Vero细胞系gE/gI-Cas9-Vero。利用该细胞系通过病毒传代的方式实现了病毒基因的缺失编辑,该方法与传统的瞬时转染质粒进行病毒基因编辑相比较,基因编辑效率可提高13%,经过传代培养,基因编辑的病毒占总病毒的80%左右。将编辑的病毒在Vero细胞上进行蚀斑克隆,通过PCR鉴定挑选未扩增出特异性条带的蚀斑克隆病毒为缺失病毒,从缺失病毒中选取1株进行多轮蚀斑纯化,经过基因测序和蛋白水平的检测,获得了1株缺失gE和gI的PRV,该毒株命名为PRV-WC01 Del-gE/gI。对获得的PRV-WC01 Del-gE/gI进行了生长特性分析,结果显示该病毒在Vero细胞上的早期生长较亲本毒株PRV-WC01略低,PRV-WC01 Del-gE/gI和PRV-Bartha-K61株在蚀斑形态和大小上没有明显差异,略小于PRV-WC01亲本毒株;小鼠致病性实验显示,PRV-WC01Del-gE/gI与亲本株相比,虽然延缓了小鼠的死亡时间,但仍可致小鼠死亡。将PRV-WC01 Del-gE/gI株的细胞培养滴度为108.00TCID50/mL病毒液经0.1%甲醛灭活,加入MONTANIDETM ISA201 VG佐剂制备免疫原,接种21日龄仔猪。经过2次免疫,在2免后21d用WC01株以10×LD50/头的剂量进行攻毒,同时设置Bartha-K61活疫苗免疫攻毒组。结果表明,灭活的PRV-WC01 Del-gE/gI抗原和Bartha-K61活疫苗均能够诱导产生特异性抗体和中和抗体。WC01 Del-gE/gI免疫原组比Bartha-K61活疫苗组产生针对PRV-WC01株的中和抗体高16倍,PRV-WC01株强毒攻击免疫猪后,Bartha-K61组猪只表现为持续高温,甚至出现惊厥和共济失调。并且1头猪死亡。WC01 Del-gE/gI组猪只除了一过性体温升高外,无其他临床症状,对PRV-WC01强毒攻击产生100%临床保护。感染14 d剖杀剩余存活的实验猪,对组织病毒载量以及器官病理变化进行了检测。结果均表明,与Bartha-K61免疫组相比,灭活的PRV-WC01 Del-gE/gI抗原免疫组各组织病毒基因组拷贝数较Bartha-K61免疫组低103-104。剖检后观察各组织器官没有眼观的病理病变。以上结果进一步证明灭活的PRV-WC01Del-gE/gI株免疫原与Bartha-K61传统疫苗相比,能对现地流行毒株提供更好的免疫保护作用。综上,本研究在免疫猪群中分离到PRV流行毒株WC01株,利用慢病毒包装系统构建了包含gE和gI基因的sg RNA以及Cas9蛋白的稳定表达细胞系gE/gI-Cas9-Vero,通过在gE/gI-Cas9-Vero上接种PRV-WC01株病毒,并经多次细胞克隆纯化筛选获得了双基因缺失株PRV-WC01 Del-gE/gI;对该毒株的生长特性、毒力特性以及免疫原性进行了测定,为该毒株作为潜在的灭活疫苗候选毒株提供了理论依据和物质基础。