Genistein(5,7,4’——三羟基异黄酮)是一种植物雌激素,是大豆黄酮类的主要成分之一。九十年代初的流行病学调查资料显示,摄用高豆类饮食与乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的低发病率有关。近年来,大量研究证实了Genistein具有广泛的抗肿瘤、抗增殖作用,其作用机制为多重抑瘤效应,包括抗氧化作用,特异性抑制酪氨酸磷酸化,抑制肿瘤浸润、转移及新生血管形成,促进肿瘤细胞分化,减低肿瘤恶性程度,引起肿瘤细胞G2/M周期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡等等。但由于该药在体内分布特异性不够强,且因有弱雌活性不能随意大剂量给药等因素,局部不易达到致死作用浓度,已成为阻碍其发展的瓶颈。研究表明利用单抗导向是解决这一问题的有效途径之一。最近研究还表明:外源性凝血级联反应启动因子——组织因子(Tissue factor,TF,又称凝血因子Ⅲ)在多种肿瘤细胞和实体瘤血管内皮细胞表面有高表达,而生理情况下与血液直接接触的组织都是不表达TF的,这使药物选择性攻击肿瘤血管成为可能。经证实TF不仅能促进肿瘤血管生长,还与肿瘤浸润、转移密切相关,并常因肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞的分泌及高表达、肿瘤浸润、血行转移或放、化疗、手术创伤等原因大量入血,引起肿瘤病人严重的并发症——弥散性血管内凝血(Disseminated intravascular coagulation,DIC)。有学者认为TF堪称肿瘤细胞利用凝血级联反应途径生长、转移的枢纽。因此,TF作为一个抗肿瘤血管药的潜在作用靶点为许多国际知名肿瘤学学者所看好。上述作用的机理研究至今尚不十分清楚,多数研究认为与TF的促凝活性及细胞内信号转导有关,其中TF胞浆区末端3个丝氨酸残基的磷酸化是细胞内信号转导的关键所在。值得注意的是:这种细胞内信号转导是PKC依赖性的。PKC和酪氨酸激酶抑制剂可以抑制TF诱导瘤细胞表达VEGF等多种促血管生长因子,PKC 活化剂如PKC-α则可提高TF诱导的VEGF表达。而Genistein不仅是一种被广为看好的潜在抗癌药物,也正好是一种传统的酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)特异性抑制剂。 本课题通过碱基定点突变(P10Q、K32E、K341A等)、毕赤酵母真核表达等技术对小鼠TF的生理性配体—小鼠凝血因子Ⅶ(Mice Coagulation factor Ⅶ,mFⅦ)进行重<WP=12>组表达,在保留重组蛋白TF结合活性,破坏促凝血活性的基础上,将其与Genistein交联构建一种新的复合物。尝试从抑制TF的促凝活性及细胞内信号转导双方面入手,并利用靶向蛋白提高Genistein局部药物浓度,充分发挥其多重抑瘤效果,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长、转移。本研究内容主要分三个部分:①rmFⅦ-pPIC9K酵母表达载体的构建。通过RT-PCR方法从小鼠肝脏组织获得mFⅦ cDNA全长,并对其进行定点突变,测序正确后再用常规PCR方法扩增出所需目的片段,NotⅠ+EcoRⅠ双酶切pPIC9K质粒及目的片段后分别铺胶回收,连接过夜。所构建载体均转化大肠杆菌,快速抽提阳性质粒DNA,酶切及测序鉴定。 ②rmFⅦ蛋白的毕赤酵母表达、纯化及活性初步鉴定。构建载体以电穿孔法转染酵母菌GS115,在山梨醇选择平板(HIS-)上挑取阳性克隆依次进行PCR鉴定、G418筛选、Mut筛选及小量摇瓶培养实验,寻找高拷贝菌株与表达蛋白的最佳收获时段,筛选结束后大量摇菌,于最佳时段收获上清液,经超滤浓缩、透析脱盐、亲和层析纯化后将所收集样品冷冻抽干备用。纯化蛋白用SDS-PAGE、Western-Blot鉴定,并用凝血实验和免疫组化法检测其生理活性。③rmFⅦ与Genistein的交联及交联产物抗癌活性研究。将rmFⅦ与Genistein用紫外交联、纯化后,取小鼠黑色素瘤细胞B16 、人乳腺癌细胞MCF-7 ,通过MTT比色法分析交联产物对细胞增殖的影响;制作裸鼠皮下移植瘤和实验性肺转移模型,研究交联产物对肿瘤生长、新生血管形成以及血行转移的影响。获得以下主要结果:1. 从小鼠肝脏成功扩增出mFⅦ cDNA开放阅读框架全长序列,测序结果与Genbank资料(编号AK089402)对应序列完全相同。并对上述序列进行 3个氨基酸的定点突变(P10Q、K32E、K341A),测序证实与设计位点完全一致 ;2. 从mFⅦ正常及突变全长序列,PCR扩增出3个目的片段,酶切连接后构建了3种rmFⅦ-pPIC9K酵母表达载体(M1:mFⅦ轻链-pPIC9K;M2:K341A-mFⅦ-pPIC9K;M3:QEA-mFⅦ-pPIC9K),经测序证实完全符合预想设计,且与酵母开放阅读框架完全正确匹配;3. 完成了3种rmFⅦ蛋白的酵母表达、纯化及凝血、结合活性鉴定。与正常mFⅦ相比,3种重组蛋白的凝血活性均基本丧失,同时M2、M3保持了较高的TF结合活性,M3结合速度可显著加快;但M1未能表现预期的TF结合活性,说明FⅦ重链对FⅦ与TF的结合同样是必不可少的;4. 将重组蛋白与Genistein成功交联,获得了一种新的交联复合物rmFⅦ-<WP=13>Gen,经纯化后纯度达90%以上;5. 对rmFⅦ-Gen交联产物的抗癌活性进行了体内、体外初步研究。结果证实:rmFⅦ-Gen抑制肿瘤细胞B16 与MCF-7增殖的IC50较Genistein降低 100倍以上;较低剂量给药(0.1μmol/kg体重,尾静脉注射,隔日×6次)可使裸鼠皮下移植瘤体积、瘤内微血管密度及VEGF表达显著降低,并使B16的实验性肺转移受到明显抑制(抑制率达70%以上)。