基于线粒体的结构和功能探讨三味干姜散保肝作用及其入血成分研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:gustczh
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目的:本课题从保护肝脏线粒体结构和功能的角度出发,复制酒精性肝损伤模型和ConA免疫性肝损伤模型,探讨三味干姜散的保肝机制,并研究其入血成分,为三味干姜散的临床应用奠定物质基础。方法:1.将72只SD大鼠随机分为正常组、酒精模型组、水飞蓟素阳性组、三味干姜散高、中、低剂量干预组。除正常组以外,各组上午灌胃55%酒精,下午灌胃相应药物,连续10d,正常组灌胃相应剂量的蒸馏水,制备酒精性肝损伤大鼠模型,在末次给药12h以后,2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,分离的血清用于检测肝功指标ALT、AST,肝脏用于HE切片染色进行病理观察,提取的肝脏线粒体用于检测线粒体膜电位、膜通透性、SOD、8-OHdG、呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ;制备肝匀浆检测MDA、GSH、GSH-Px,RT-PCR 检测肝细胞中 Nrf2、Bach1 和 HO-1 mRNA 的表达;Western Blot检测肝组织中Nrf2、Bach1以及HO-1蛋白的表达水平。2.将72只KM小鼠随机分为正常组、ConA模型组、水飞蓟素阳性组、三味干姜散高、中、低剂量干预组。除正常组以外,各组每天灌胃相应体积药物1次,连续7d,正常组灌胃等体积的蒸馏水,在末次给药以后12h,除正常组外,其余各组尾静脉注射ConA 25mg/kg,制备ConA免疫性肝损伤模型。造模4h后眼球取血,分离出的血清用于检测肝功指标ALT、AST,分离的肝脏用于HE切片染色进行病理学观察,提取的肝脏线粒体检测线粒体膜电位、SOD、8-OHdG,制备肝匀浆测定MDA、GSH、GSH-Px。3.通过超高效液相-质谱联用仪测定,并建立三味干姜散化学成分信息库,利用Peakview软件对三味干姜散含药血清、空白血清、单复方化合物成分进行筛查,以6-姜酚对照品,以期寻找三味干姜散入血成分。结果:1.用55%酒精给SD大鼠灌胃造模10天后,发现酒精模型组血清中的ALT、AST水平升高(P<0.01);HE切片染色病理观察结果表明,酒精模型组肝小叶之间的界限不是很清晰,肝细胞索发生紊乱,肝窦范围变窄,肝细胞也浊肿,而胞质出现疏松,淡染,更有大部分的肝细胞出现肿胀,呈现出气球样的病变。酒精模型组的荧光强度比值下降,表明JC-1单体增多,膜电位△Ψm下降(P<0.05),在1Omin以内A540值迅速下降,△A540值上升明显(P<0.05),表明线粒体容积增大,光散射性下降。SOD酶活性显著下降(P<0.01),GSH-Px酶活性显著下降(P<0.01),GSH活性下降(P<0.05);MDA活性显著增加(P<0.01),8-OHdG含量显著增加(P<0.01);2.呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ酶活性显著性降低(P<0.01);肝组织中的Nrf2、Bach1、HO-1mRNA的表达水平提高,其中Nrf2、HO-1mRNA表达水平(P<0.05),Bach1 mRNA表达水平(P<0.01)。三味干姜散干预组肝细胞水肿症状均有不同程度缓解,三味干姜散高剂量能降低血清中ALT水平(P<0.05),能升高SOD酶活性(P<0.05),升高GSH-Px酶活性(P<0.05),能增加GSH酶活性(P<0.01),10min内△A540下降(P<0.05),能降低8-OHdG含量(P<0.01),降低MDA活性(P<0.01),能显著增加呼吸链复合物Ⅲ酶活性(P<0.01),增加呼吸链复合物Ⅰ(P<0.05),能上调Nrf2和HO-1mRNA的表达(P<0.05);中剂量能降低血清中ALT、AST水平(P<0.05);能增加GSH酶活性(P<0.01),能显著降低8-OHdG含量(P<0.01)、降低MDA活性(P<0.05),能显著增加呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ酶活性(P<0.01);低剂量组能降低MDA活性和8-OHdG含量(P<0.05),增加呼吸链复合物Ⅲ酶活性(P<0.05)。2.尾静脉注射ConA造模后,发现模型组小鼠血清中ALT、AST水平显著上升(P<0.01);HE切片染色病理学观察发现,模型组的肝细胞发生水肿,有的充血坏死,肝小叶结构也受到破坏,严重的还出现小灶样坏死以及炎症细胞浸润,汇管区被大量炎性细胞所浸润。模型组的荧光强度比值下降,表明JC-1单体可能增多,膜电位△Ψm明显下降(P<0.05),并且在10min以内A540值迅速下降,△A540值明显上升(P<0.05),表明线粒体容积可能增大,光散射性下降;SOD酶、GSH-Px酶活性显著下降(P<0.01),GSH活性下降(P<0.01);MDA活性显著增加(P<0.05),而8-OHdG含量却显著增加(P<0.01);在病理观察中,三味干姜散干预组对于模型组出现的肝细胞状况都有着不同程度缓解,其中高剂量组能显著降低血清中的ALT、AST的含量水平(P<0.01),能升高SOD酶活性(P<0.05),升高GSH-Px、GSH酶活性(P<0.01),能降低8-OHdG含量(P<0.01),降低MDA活性(P<0.01);中剂量组的荧光强度比值增加,表明JC-1聚合物可能增多,膜电位△Ψm明显上升(P<0.01),还能增加GSH-Px酶活性(P<0.05),能降低8-OHdG含量(P<0.01);低剂量能升高GSH酶活性(P<0.05)。3.以6-姜酚作为对照品,对空白血清、三味干姜散含药血清、复方以及单方进行检测,发现6-姜酚在含药血清、三味干姜散复方以及干姜单方中的保留时间基本一致,其在二级质谱图中的特征碎片峰基本一致,提示6-姜酚可能是以原型入血。结论:1.三味干姜散的保肝作用与其对肝脏线粒体的保护有关,具体表现为保护线粒体的膜结构、提高抗氧化酶的数量,减轻DNA的氧化损伤以及恢复线粒体的氧化还原系统,调控内源性抗氧化系统,减轻机体脂质抗氧化反应,上调Nrf2、Bach1以及HO-1基因和蛋白的表达。2.经过UPLC-MS法检测得出6-姜酚可能是三味干姜散的入血成分,并以原型入血。
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