鱼尼丁受体(Ryanodine Receptor)是一类控制Ca2+从胞内钙库向外释放的配体门控钙离子通道,主要在肌肉细胞的肌浆网和神经元的内质网中存在,对维持细胞内Ca2+浓度的稳定具有不可替代的作用。哺乳动物有3种不同类型的鱼尼丁受体,包括RyR1、RyR2和RyR3。而昆虫体内只存在1个编码鱼尼丁受体的基因,且在氨基酸水平上与哺乳动物3种同工型鱼尼丁受体的同源性均不高于50%,这为研制对人畜低毒而对害虫高效的化学药剂提供了可能。柑桔粉虱和褐色桔蚜均属半翅目柑桔害虫。近年来,由于桔园品种种植单一、化学农药过度使用甚至滥用,大量桔园害虫的天敌被杀死,造成生态系统失去平衡,害虫抗药性问题愈发严重。因此,以鱼尼丁受体为作用靶标的双酰胺类杀虫剂逐渐成为研究的热点。据此,本学位论文针对柑桔粉虱和褐色桔蚜鱼尼丁受体及其选择性剪接进行了较为系统的研究工作,旨在为研制出以该基因为作用靶标的高效、安全杀虫剂提供理论基础。本论文主要研究结果如下:1.柑桔粉虱和褐色桔蚜对常用杀虫剂的敏感性测定利用改进后的滤纸药膜法和玻片浸渍法,对采自学校网室的柑桔粉虱和褐色桔蚜对5种常用杀虫剂(阿维菌素、氯虫苯甲酰胺、吡虫啉、毒死蜱、高效氯氰菊酯)的敏感性进行了测定。结果表明,5种药剂对柑桔粉虱的毒杀作用由强到弱分别为阿维菌素、吡虫啉、氯虫苯甲酰胺、毒死蜱和高效氯氰菊酯,而对褐色桔蚜的毒杀作用由强到弱依次为吡虫啉、氯虫苯甲酰胺、毒死蜱、高效氯氰菊酯和阿维菌素。2.柑桔粉虱和褐色桔蚜鱼尼丁受体基因的克隆及结构分析基于柑桔粉虱和褐色桔蚜转录组测序数据,利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)分别克隆得到2种害虫的鱼尼丁受体基因DcRyR和TciRyR编码完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列。其中,DcRyR的ORF长15,381 bp,编码5,126个氨基酸残基,GenBank登录号为KP733848,预测蛋白质分子量为579.45 KDa,等电点为5.49。TciRyR的ORF长15,315 bp,编码5,104个氨基酸残基,GenBank登录号为KP733849,预测蛋白质分子量为580.08 kDa,等电点为5.49。氨基酸序列分析表明,DcRyR和TciRyR与其他昆虫鱼尼丁受体的相似性介于70%-90%之间。其中,柑桔粉虱DcRyR与烟粉虱BtRyR氨基酸序列相似度最高,相似性为95.1%。褐色桔蚜TciRyR与桃蚜MpRyR、豌豆蚜ApRyR的亲缘关系最近,相似性分别高达98.2%和98.1%。然而,DcRyR和TciRyR与哺乳动物的相似性仅在43%-46%之间。对柑桔粉虱和褐色桔蚜鱼尼丁受体基因结构域的预测发现,dcryr和tciryr均具有许多鱼尼丁受体重要的功能结构区域,如sd结构域、mir(甘露糖转移酶)结构域、2个rih(ryr和ip3r同源)结构域、3个spry(spla和ryr)结构域、4个ryr重复结构域及rihassociated。在c末端均存在6个跨膜结构域(tm1-tm6),分别对应6个高度疏水区域。此外,dcryr和tciryr均存在ef-hands、porehelix和作为ca2+释放通道的孔道形成区域一部分的gxrxgggxgd基序,且以上序列与其他已知的鱼尼丁受体基因序列相似度极高。总的来讲,dcryr和tciryr具有鱼尼丁受体的全部典型结构区域,具有结构上和功能上的保守性。3.柑桔粉虱和褐色桔蚜鱼尼丁受体基因mrna表达分析荧光定量pcr检测结果显示,dcryr和tciryr在2种害虫不同发育阶段和不同体段的样品中均有所表达。其中,dcryrmrna表达量在柑桔粉虱成虫头部和胸部显著高于腹部,dcryrmrna的表达量在卵期最高而在若虫期最低。tciryr的表达量在褐色桔蚜成虫期头部高表达,在胸部和腹部的表达水平无显著性差异。4.柑桔粉虱和褐色桔蚜鱼尼丁受体基因选择性剪接分析通过对dcryr多个cdna克隆测序,序列分析发现dcryr存在2种类型共4个选择性剪接子,包括2个选择性外显子(as1a和as1d)和1对互斥外显子(as1b和as1c)。通过特异性pcr检测发现以上4个外显子在柑桔粉虱不同体段和不同发育阶段的表达频率存在差异。其中,as1a(+)在柑桔粉虱成虫胸部发生的频率较高,as1d(+)在若虫期更容易发生。而as1b/c作为互斥外显子,as1b在所有发育阶段和体段的发生频率均高于as1c。同样,通过对tciryr多个cdna克隆测序,序列分析发现tciryr仅存在1个选择性剪接位点(as2),进一步克隆其基因组序列,分析发现该选择性剪接由内含子保留机制所致,并会导致蛋白质翻译的提前终止。在对tciryr选择性外显子的特异性pcr检测研究中发现as2(-)在若虫和成虫以及成虫头部、胸部和腹部的表达频率均显著高于as2(+)。综上所述,本学位论文对柑桔粉虱和褐色桔蚜校内网室种群对常用杀虫剂的敏感性进行了监测;基于柑桔粉虱和褐色桔蚜的转录组数据,分别克隆得到其鱼尼丁受体基因dcryr和tciryr,分析了功能结构区域特性;采用荧光定量pcr技术解析了这2个基因分别在2种害虫不同发育阶段和不同体段的mrna表达模式;序列分析发现dcryr和tciryr分别存在4个和1个选择性剪接子,明确了选择性剪接在2种害虫不同发育阶段和体段发生的相对频率。研究结果丰富了昆虫鱼尼丁受体基因的生物学信息,对进一步提高对昆虫鱼尼丁受体功能和结构的认识以及新型、高效、安全杀虫剂的研发具有重要的指导价值。