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大豆(Glycine max (L.) Merr)是人类饮食和畜禽饲养最重要的植物蛋白来源之一含有人体必需的氨基酸。人类对大豆蛋白的消耗超过其它一般食品资源。尽管大豆是一种优异的蛋白资源,但含硫氨基酸半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)含量低,限制其营养价值。利用生物工程手段改良蛋白品质即提高食用大豆含硫氨基酸的含量,有效的措施之一就是对涉及硫同化路径中的酶进行遗传操作。本文主要对含硫氨基酸代谢途径中的关键酶基因进行了克隆及功能鉴定,一方面有助于了解含硫氨基酸生物合成与调控的分子机制,另一方面也为利用基因工程方法调节含硫氨基酸途径中代谢流的分布,提高含硫氨基酸含量提供了基因靶点,具有重要的理论意义和应用价值。本研究主要取得了以下研究进展：一、克隆了大豆NN88-31胱硫醚β-裂解酶(cystathionineβ-lyase)GmCBL基因的cDNA全长,对其进行了序列、表达分析及转基因功能鉴定。序列分析表明,GmCBL基因编码的蛋白与其它植物CBL蛋白有很高的同源性,C端很保守,该基因属于吡哆醛-5’-磷酸依赖酶α’家族γ亚家族,具有CBL蛋白固有的特征和保守域：N端有引导CBL定位于质体的叶绿体转运肽、吡哆醛-5’-磷酸结合位点、底物辅因子结合口袋和同型二聚体接触面,具有CGS_like特异位点、AAT_like超基因家族和Cys_Met_meta_PP多酶结构域。以克隆的GmCBL基因的cDNA序列为探针,搜索大豆基因组数据库,GmCBL基因定位于大豆3号染色体Gm03,该基因的编码区包括13个外显子和12个内含子。系统发育分析表明GmCBL被划分在双子叶植物类型中,并且GmCBL和MsCBL亲缘关系很近。QRT-PCR进行组织表达分析,GmCBL在15d和45d荚皮中表达量最高,其次是50d荚皮,其它时期荚皮中表达量很低。在种子发育的八个时期中,GmCBL在45d表达量最高。在根、茎、叶、花四个组织中,GmCBL基因在根、花中表达量较高。GmCBL基因受盐、虫、伤害、重金属镉诱导。转基因烟草Southern Blot分析,GmCBL基因是以单拷贝形式存在于烟草基因组中。转基因株系与野生型烟草相比Met含量均极显著提高,而在表型上没有差异。二、大豆O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(O-acetylserine(thiol)lyase)GmOASTL4基因转烟草功能验证。结果表明,GmOASTL4基因在两种不同启动子作用下表达量和OASTL酶活不同：35S启动子作用下GmOASTL4基因表达量和OASTL酶活显著高于αp启动子；种子中Cys、Met和自由总氨基酸含量,αp启动子>野生型>35S启动子。对35S启动子作用下植株进一步分析。Southern Blot分析,GmOASTL4基因是以单拷贝形式存在于烟草基因组中。通过表型和内源保护酶分析,转基因植株具有一定的抗干旱、盐、重金属(镉、铜)作用。转基因植株Cys含量比野生型植株高。在重金属胁迫下,Cys、Met和自由总氨基酸含量,转基因植株显著高于野生型植株。除甘露醇胁迫外,转基因植株Met含量都比野生型植株增加,并且镉胁迫下,Met含量极显著高于对照。荧光定量PCR (QRT-PCR)分析胁迫下的转基因植株,GmOASTL4基因表达量低于未胁迫植株,但极显著高于野生型植株。三、克隆了蒺藜苜蓿胱硫醚β-裂解酶(cystathionineβ-lyase) MtCBL基因的cDNA全长,对其进行了序列、表达分析及功能鉴定。序列分析发现,MtCBL基因与大豆中克隆的GmCBL基因同源性高达85%,属于吡哆醛-5’-磷酸依赖酶α家族丫亚家族,具有GmCBL基因编码蛋白的结构域。MtCBL基因蛋白的三级结构,与拟南芥的胱硫醚-Y裂解酶晶体结构序列匹配度达82.32%,主要由10个α-螺旋和12个p-折叠片组成。MtCBL蛋白有多个磷酸化作用位点。系统发育分析表明,MtCBL和蒺藜苜蓿MsCBL同被划分在双子叶植物类型中,并且MtCBL和MsCBL亲缘关系很近。组织表达显示MtCBL在嫩叶和老叶中表达量高,而在根、茎、花中表达量低,且在嫩叶中表达量最高。转基因烟草QRT-PCR分析,MtCBL基因稳定表达,在不同植株间有发现较大的差异。转基因株系Met含量没有提高。