研究背景与目的：肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康和生命。2016年1月25日,全球癌症领域顶级杂志--《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)在线发表了国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示：2015年中国癌症总发病429.16万例,总死亡281.42万例,其中肺癌的发病率最高,并且肺癌的死亡率也排在各种不同类型肿瘤之首。据统计,2015年全国肺癌发病73.33万,死亡61.02万。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,然而肺癌的5年生存率仍然低于15%。究其原因,一方面限于目前对肺癌的发生、发展及转移等机制还不是非常明确,同时缺乏有效、敏感的早期诊断、监测等指标,患者就诊时往往已经是肿瘤晚期,这是导致患者预后不良的主要因素；另一方面,目前肺癌的治疗手段除了手术以外,常规的放／化疗有效率不高,虽然靶向药物的临床应用使得肺癌的治疗取的比较瞩目的进展,但是如何提高药物治疗的有效率,解决化疗及靶向药物治疗过程中出现的耐药问题,仍然是当前肺癌治疗过程中亟需解决的一个问题。已有的研究表明,基因表达和基因调控异常可能是恶性肿瘤发生、发展的内因和基础,通过对肺癌发生机制进行深入探讨,寻找可能存在的与肺癌生物学活性相关的生物学标记物,探讨其作用于肺癌发生、发展的机制,从而做到对肺癌治疗的有的放矢。在早期的肿瘤研究中,人们的注意力主要集中在蛋白编码基因在肺癌发病机制上的研究。上世纪末进行的人类全基因组研究发现,在人类基因组的转录本当中,大约只有2%的基因具有编码蛋白能力,与此同时,90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力,他们往往被转录成非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA),这些ncRNAs发挥的基因调控作用在肺癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用。依据核苷酸的长度,我们把ncRNA又分为两大类：分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码RNA和核苷酸长度大于200nt的长链非编码RNA (lncRNA)。在相当长的一段时间里,人们一度对短链ncRNA的研究比较多,研究结果也提示了短链非编码RNA与宿主基因之间的相互调控作用在肿瘤演变的过程中扮演着重要的角色。随着近几年对lncRNA的研究不断深入,越来越多的研究提示lncRNA与短链RNA在肿瘤的演变过程中,发挥着类似的调控基因功能的作用。lncRNA一度曾被认为仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录时的副产物,是基因转录时的“噪音”和“垃圾”,并不具有特定的生物学功能,是一个“暗物质”。然而,随着这些年的研究发现,lncRNA在多种类型肿瘤细胞(包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等)的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的过程,至此,lncRNA的面纱才逐步揭开。随着研究的逐步深入,越来越多的lncRNA在基因调节等方面的功能被揭示出来。在已完成的一些关于1ncRNA与肺癌关系的研究中,提示lncRNA通过干扰蛋白编码基因表达、介导染色质重构和蛋白修饰、干扰nRNA的剪切、调控基因表达水平、调节响应单白活性、改变蛋白的胞质定位等机制参与肺癌细胞的增殖、侵袭转移、凋亡以及细胞耐药等一系列过程。但总体来说,lncRNA的调控作用概括起来主要在三个层面实现,分别为：转录调控、转录后调控和表观遗传学调控。为了更好的了解lncRNA在非小细胞肺癌转化过程中的作用,我们收集了广州军区广州总医院胸外科2014年1月到2014年6月临床上符合本研究的83例原发性非小细胞肺癌的标本及其癌旁组织(>5cm),通过基因芯片进行筛选,发现一些在肺癌组织与癌旁组织中表达有差异的LncRNA,并在其中挑选出表达差异比较大的lncRNA DB327252作为本课题的研究对象,通过与所收集的标本的临床病理资料进行比较,探讨lncRNA DB327252的表达与临床特征之间的关系。进一步的研究是通过选择lncRNA DB327252表达水平比较高的肺癌A549&16HBE-T细胞作为研究对象,构建干扰序列siRNA,通过转染沉默A549及16HBE-T细胞株中的DB327252的表达,观察目的基因沉默后在细胞周期、凋亡、侵袭能力、迁移能力等方面发生的变化,进一步构建shRNA质粒稳定表达载体,通过体外软琼脂集落实验及裸鼠体内成瘤实验,观察lnc DB327252表达与肿瘤生长之间的关系。方法1.肺癌组织样本采集收集2014年1月至2014年6月期间,中国人民解放军广州军区广州总医院胸外科进行的肺癌根治手术或肺癌姑息性切除手术患者的肺癌原发病灶的肿瘤组织及癌旁组织标本(要求癌旁组织距癌中心组织距离>5cm),选取符合本研究要求的83例原发性肺非小细胞肺癌标本进行研究,标本要求在术前未进行过放化疗及免疫、靶向治疗,同时收集肿瘤样本患者的一般临床信息和详细的病理资料,建立随访数据库。生物标本的收集符合无菌的原则,并征得患者本人同意及广州军区广州总医院伦理委员会的批准。2.细胞系及培养方法通过购买或受赠获得正常人类支气管上皮细胞株BEAS-2B、16HBE-N;肺癌细胞株A549、H1299、H446、H460以及通过恶性诱导转化成的16HBE-T细胞株,使用含有10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和1%青链霉素混合液(100IU/ml青霉素,100ug/ ml链霉素)的MEM培养基(Modified Eagle’s Medium,美国HyClone公司)或RPMI-1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行培养,置于37℃,5 %(v/v) CO2,饱和湿度的恒温培养箱中。3.总RNA提取及qRT-PCR分析应用Trizol法提取组织细胞总RNA,应用荧光染料法(SYBR Green II)进行基因芯片实验,检测1ncRNA的表达含量,并通过实时定量(qRT-PCR)检测各细胞株中的lncRNA DB327252的表达水平,并筛选出表达比较高的细胞株作为进一步实验研究的对象。4. SiRNA干扰序列的瞬时转染 制备lncRNA DB327252 siRNA/ Lipofectamine-2000复合物,依照转染说明书中的步骤对A549、16HBE-T细胞进行转染,用qRT-PCR对干扰的效果进行定量分析,分别在4Onmol/L浓度下和转染48h后进行观察,筛选出干扰效率最高的siRNA (>70%)进行下一步研究。5.细胞增殖能力检测将适量细胞接种于96孔板上,分别于转染后6 h、12h、24h、48h和72h进行检测,用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)试剂盒检测A549/siRNA、16HBE-T/siRNA细胞增殖能力。全自动酶标仪检测各组样品吸光值,根据细胞增殖率计算公式,计算出细胞活力。6.平板克隆情况检测取对数生长期细胞,接种于6孔板,接种14天后观察,当肉眼可见细胞克隆时终止实验,用0.1%结晶紫染色,计算克隆形成率。7.细胞周期情况检测6孔板接种细胞后无菌抗菌素培养基37℃, 5％CO2培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞并用70%乙醇固定,-20℃过夜,再用PI染色,通过流式细胞仪检测各细胞周期细胞的分布情况。8.细胞凋亡检测将适量细胞接种于6孔板,培养基37℃,5%C02培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞,洗涤、固定、透化,按照Annexin V-FTIC/PI试剂盒说明书步骤对细胞进行染色,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。9.体外侵袭实验转染24h后,用胰酶消化并制成单个细胞悬液,于每孔5×104个细胞的密度接种于Tanswell用的24孔板的上室,将500ul含20%FBS的DMEM培养基加入小室下层,培养24h后计算细胞侵袭率。10.细胞划痕实验细胞转染24h后,待细胞生长至100%汇合时,用枪头垂直在平板上划线。把脱落的细胞冲洗干净,37℃培养基培养24h,每6h显微镜下检测一次,并拍照记录,计算细胞生长覆盖区面积比。11.软琼脂实验6孔板每孔先铺好含2ml 0.6%底层琼脂,再于每孔加2 ml含细胞混合液(细胞浓度1×104个/ml)的0.3%低熔点琼脂糖,配置成上层琼脂,培养箱培养21天后,计算细胞克隆数(>50个细胞)。12.建立稳转细胞株用500ug/ml的G418筛选培养浓度,Lipofectamine-2000转染shRNA,24h后细胞传代,继续培养,10-14天左右挑选单克隆细胞,制备成悬液并进行计数。继续培养,等待细胞大量扩增以后,提取细胞总RNA,采用荧光定量检测的办法检测目的基因的表达是否下降。13.裸鼠成瘤实验用PBS把已用胰酶消化的细胞洗涤两遍后重悬,于4周龄的BALB/c裸鼠腹股沟皮下注射分别注射约150μ1含5×106个细胞的细胞悬液,两侧腹股沟分别注射siRNA-nc和shRNA细胞作为对比。注射后每人观察裸鼠的精神状态、反应、饮食、活动力、毛色、毛顺滑度及腹股沟皮下肿瘤的生长的情况,记录成瘤的潜伏时间。成瘤后隔天应用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),28天后将裸鼠处死,解剖取出肿瘤,电子称称重。14.统计分析采用SPSS 20.0软件对测量的数据进行统计分析。所有的试验数据均至少重复3次测量,数据以x±s表示。计数资料两组间的比较用双侧t检验,3组资料的比较采用单因素的方差分析,取p<0.05为差异有统计学意义。结果1.基因芯片检测结果提取83例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织细胞的总RNA,应用基因芯片进行筛选,发现lncRNA DB327252的表达水平明显高于癌旁组织,统计学有明显差异(p<0.05)。2.LncRNA DB327152表达与肺癌临床特征的关系以中位数的LncRNADB327152表达水平(M=4.39)为界点,将临床资料分为高表达组(>4.39)和低表达组(<4.39),通过比较发现,DB327252的高表达与患者的性别、年龄、淋巴结转移不相关(P>0.05),与吸烟(p=0.045)、组织学类型(p=0.023)、肿瘤大小(p=0.037夕以及TNM分期(p=0.002)相关,其中吸烟组人群中DB327152表达高于非吸烟组人群,腺癌组的表达水平明显高于非腺癌组,≥3cm肿瘤组的表达水平高于<3cm肿瘤组,TNM/Ⅱ-Ⅳ期中的表达明显高于TNM/I期中的表达水平。3.LncRNA DB327152在不同细胞株的表达水平与正常人类的支气管上皮细胞株BEAS.2B细胞相比较,16HBE-N是BEAS-2B的(1.184±0.137)倍,差异无统计学意义(P>0.05)；16HBE-T、A549、H1299、H446、H460分别是BEAS-2B的(16.259±1.209)倍、(20.596±1.81)倍、(17.009±0.890)倍、(16.088±2.002)倍、(12.496±0.907)倍,差异均有统计学意义(p<0.05),提示在恶性肿瘤细胞中,ncRNA DB327152普遍高表达。4.筛选siRNA分别用1个阴性对照序列(siRNA-nc)和4个siRNA序列 (siRNA-1.siRNA-2.siRNA-3.siRNA-4)转染,来下调目的基因的表达,并检测转染后的干扰效果。结果发现在A549细胞株中,siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4的干扰效率分别达到66%、77%、58%,差异有统计学意义(p<0.05)；在16HBE-T细胞株中,siRNA-2、siRNA-3的干扰效率分别达到65%、67%,同样差异有统计学意义(p<0.05)。5. lncRNA DB327252对细胞增殖的影响A549细胞株中,与空白组相比,转染阴性对照组siRNA-nc的细胞存活比例为(99.15±2.87)%,差异无统计学意义(P>0.05),可将siRNA-nc作为标准。将siRNA-2组、siRNA-3组细胞与siRNA-nc进行比较,发现siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降至(36.20±1.88)%、(34.17±2.27)%,差异均有统计学意义(p<0.05);在16HBE-T细胞株中,与空白组相比,siRNA-nc组细胞存活比例为(96.21±1.2)%,差异无统计学意义(P>0.05),与siRNA-nc组相比,siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降为(37.32±5.41)%、(39.00±1.72)%,差异均有统计学意义(p<0.05),提示lnc RNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、 16HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的增殖受到明显抑制。6.平板克隆检测 观察染色后>50个细胞的克隆数,经过计算,得出A549/siRNA-1、siRNA-2克隆形成率与A549/siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05)；同样,16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2的克隆形成率与16HBE-T/ siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05),提示lncRNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、6HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的克隆能力下降。7. lncRNA DB327252对细胞周期的影响应用流式细胞仪对PI染色后的细胞进行检测发现,在A549/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至80.7%,差异有统计学意义(p <0.05)；siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至81.3%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至5.61%、7.87%,但差异无统计学意义(P>0.05);在S组中, siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至13.72%和10.88%,差异均无统计学意义(P>0.05);16HBE-T/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至84.22%,差异有统计学意义(p<0.05);siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至83%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至6.85%、7.20%,但差异无统计学意义(p>0.05);在S组中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至8.93%和9.80%,差异均无统计学意义(p>0.05)。说明lncRNA DB327252表达下调,位于细胞周期中G0/G1期的比例增高,肿瘤生长受到抑制。8.lncRNA DB327252对细胞凋亡的影响A549/siRNA-1、siRNA-2凋亡率与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、 siRNA-2凋亡率与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05),提示lncRNA DB327252基因在调节NSCLC细胞演变过程可能与细胞的凋亡无关。9. IncRNA DB327252对细胞侵袭能力的影响 转染处理24h后,A549/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力降低,但与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05); 16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力也降低,与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。10. IncRNA DB327252对细胞迁移能力的影响A549/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。11.软琼脂集落实验在A549细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(64.93±5.10)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显著降低至(23.60±5.05)%,差异有显著的统计学意义(P<0.01);16HBE-T细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(67.73±6.56)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显著降低至(34.80±6.06)%,差异有显著的统计学意义(P<0.01)。12.裸鼠成瘤实验将shRNA和shRNA-NC转染的A549和16HBE-T细胞分别注射到裸鼠腹股沟两侧的皮下,通过观察,A549/shRNA稳转组的肿瘤生长速度要慢于shRNA-NC组,P<0.05；同样,16HBE-T/shRNA稳转组的肿瘤生长速度慢于shRNA-NC组,P<0.05差异均有统计学意义。A549/shRN A组的肿瘤体积明显低于A549/shRNA-nc组(667.32±41.35 mm3 vs 1691.45±44.70 mm3),差异有明显的统计学意义(P<0.05)。重量A549/shRNA对比A549/shRNA-nc组(233.2±86.37mg vs 448.2±120.8mg),差异有统计学意义(P<0.05); 16HBE-T/shRNA组肿瘤体积也低于16HBE-T/shRNA-nc组(633.18±46.75 mm3 vs 1448.20±85.69 mm3),差异有统计学意义(P<0.05),重量16HBE-T/shRNA 对比 16HBE-T/shRNA-nc组(267.3±74.86mg vs 391.4±86.61mg),差异具有统计学意义(P<0.05)。提示：DB327252基因表达下调后,体内试验中肿瘤的成瘤速度及成瘤体积及重量均出现了下降,说明了肿瘤的生长减慢。结论1. LncRNA DB327252在非小细胞肺癌组织中呈高表达状态,具有类癌基因的功能,与非小细胞肺癌恶性程度增加相关。2. LncRNA DB327252的表达水平在性别、年龄、淋巴结转移上无统计学差异(P>0.05),在吸烟、病理组织学类型、肿瘤大小、TNM分期上的差异具有统计学意义(P<0.05),在吸烟组、腺癌组、肿瘤≥3cm组、TNM分期Ⅱ-Ⅳ期组中呈现高表达。3. LncRNA DB327252 ± A549、H1299、H446、H460及16HBE-T细胞株中均呈现高表达状态,具有恶性的生物学活性；4. LncRNA DB327252主要通过调控A54、16HBE-T细胞增殖和影响肿瘤细胞周期来促进肿瘤的转化过程;5.体外细胞软琼脂实验及裸鼠体内成瘤实验证实LncRNADB327252在促进肿瘤生长方面发挥着重要的作用。