条件性表达YY1真核表达载体的构建及鉴定

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:samsam1005
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前列腺癌(Prostate Cancer)是男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤,欧美国家是该病的高发区。近年来,我国前列腺癌的发病率逐年上升,且有年轻化、恶性化趋势。目前我国在研究前列腺癌发生发展及转化机制、相关微环境对疾病的影响、激素非依赖性前列腺癌(Hormonal Refractory Prostate Cancer,HRPC)有效治疗药物研发等方面,与国际先进水平差距较大。Yin Yangl(YYl)是一类广泛存在于人和动物细胞核中的核转录因子,具有双重转录活性。研究表明,YYl在多种组织肿瘤细胞中表达异常,所以研究YYl在肿瘤发生发展、侵袭及转移中的作用具有重大意义,将有望在判断肿瘤患者的预后和肿瘤靶向治疗中取得突破。利用基因工程技术构建前列腺癌动物模型是目前研究前列腺癌最有效的途径,有利于进一步揭示前列腺癌发生发展机制、抗前列腺癌药物的筛选及选择有效治疗的方法。本研究整合PCR技术、Cre-Loxp重组酶系统、基因重组等分子生物学技术构建带有多个荧光标签的条件性表达YY1的重组质粒,为后续建立组织特异性表达YY1的转基因鼠病理模型奠定基础。该重组质粒的构建需要在所选用的工具载体pSL4-puro的不同位点插入多个所需的基因片段,首先将工具载体中的内部核糖体进入位点元件(internalribosome entry site,IRES)序列后面的purocymin序列切除,随后根据需要插入一个多克隆位点(命名为Linker7),并将重组质粒命名为pSL4-Linker7,紧接着在Linker7序列中插入生物荧光素酶编码基因(fluc)与绿色荧光蛋白编码基因(egfp)作为报告基因,为确保fluc和egfp能够独立表达,相邻的荧光基因之间通过p2a序列间隔。然后在pSL4-Linker7的启动子CMV与YY1cDNA编码序列之间插入两边均带有loxp序列的一段3×stop codons (tgatagtga)+SV40poly A片段,在与yy1相连的cDNA编码序列中存在IRES,通过一系列酶切验证,重组质粒pSL4-Loxp-YY1-Fluc-EGFP成功构建。随后将Cre片段插入到质粒pcDNA3内构建重组质粒pcDNA3-Cre。最后将构建的两个重组质粒共转染至Hela细胞进行表达检测,通过一系列相关表达检测结果也显示成功构建了可以诱导表达的重组质粒pSL4-Loxp-YY1-Fluc-EGFP。通过条件性表达YY1的重组质粒的构建为前列腺癌临床治疗提供较为理想的转基因动物模型奠定基础。
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