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第一部分:肝癌PDX模型的构建与鉴定目的:建立肝癌患者新鲜肿瘤组织来源的小鼠移植瘤模型作为药效评估平台。方法:将肝癌患者新鲜的肝癌组织接种到小鼠皮下用于构建肝癌PDX皮下移植瘤模型。取初代构建成功的肝癌PDX模型的瘤块,做肝癌的小鼠肝脏原位PDX模型构建。HE染色、Western blot和免疫组织化学染色等方法用于初步鉴定PDX模型与临床肿瘤组织遗传分子特征、以及传代过程中生物学特征的稳定性。结果:我们成功建立了17例肝癌患者PDX皮下移植瘤模型(成功率30.9%)以及2例肝癌小鼠肝脏原位移植模型。通过HE染色观察肝癌细胞的形态学变化、以及免疫组化检测Ki67、Glypican-3的表达差异,在P1代和P3代都呈现出了一致性。表明肝癌PDX移植瘤模型在组织形态和蛋白表达方面都显示出与患者肝癌组织有较高的一致性。结论:成功建立了较为接近临床的肝癌PDX模型,可以成为合适的抗肿瘤药物评估平台。第二部分:基于PDX模型评估ATRA对肝癌的治疗作用目的:基于肝癌PDX模型平台初步评估Pin1抑制剂ATRA缓释片在治疗肝癌方面的作用。方法:分别选取5例3~5代肝癌PDX模型,传代后分2组,每组8只,假手术对照组和ATRA缓释片皮下包埋加药组。每周记录瘤体体积,并绘制肿瘤生长曲线。待对照组长到700-1000mm~3将瘤块取出。借助免疫组织化学染色、免疫荧光染色以及Western blot检测对照组和加药组的Pin1以及其下游Cyclin D1蛋白和肿瘤增殖相关蛋白Ki67的表达水平的差异,来判断ATRA缓释片对肝癌PDX的治疗作用。结果:在5例肝癌PDX模型中,其中有1例(样本号:17016422)肝癌PDX模型在2.5mg ATRA缓释片剂量下展现出了良好的疗效,加药组瘤块的Pin1及其下游Cyclin D1蛋白和增殖相关蛋白均呈现明显的降低。3例(样本号:17013572、18026063、17061051)在5mg的ATRA缓释片的作用下展现出了疗效,蛋白水平同上。然而有1例(样本号:17013276)该模型经2.5mg和5mg的ATRA治疗后均无效,且对照组和加药组的Pin1、Cyclin D1和Ki67蛋白表达水平无显著性差异。进一步通过免疫组化分析,Glypican-3表达的高低与ATRA的敏感性密切相关。结论:Pin1抑制剂ATRA可显著抑制肝癌PDX模型中的肿瘤生长,其敏感性与Glypican-3表达密切相关。第三部分:评估肝癌对ATRA耐药性的初步研究目的:在Pin1基因敲减的肝癌细胞中,考察Pin1抑制剂ATRA的耐药性,并探讨其潜在耐药机制;在肝癌PDX模型中,评估PDX肿瘤是否会对ATRA产生耐药性。方法:我们通过慢病毒感染肝癌细胞株Huh-7和PLC的方式有目的地将其Pin1基因进行敲减,在分子和细胞水平研究其发生的变化。首先,我们用24孔板,30000/孔种板,通过细胞计数法分别检测Huh7-scramble-4和Huh7-shpin1-4以及PLC-scramble-4和PLC-shpin1-4的增殖速度,然后通过Western blot检测Pin1以及相关蛋白的表达水平。其次,我们通过连续培养将这两株细胞传到20代,再次分别同上述方法检测Huh7-scramble-4和Huh7-shpin1-20以及PLC-scramble-4和PLC-shpin1-20两种细胞株的Pin1和其相关蛋白的变化以及用CCK8检测不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μM)ATRA的IC50值的检测。最后,我们选取Huh7-scramble-4和Huh7-shpin1-20;PLC-scramble-4和PLC-shpin1-20提取细胞RNA,送公司做这六种细胞的转录组测序分析。根据分析得到的差异基因的数据,做q-PCR和Western blot进行验证。进一步在ATRA敏感的PDX模型做连续传代给药实验,期望能通过多代给药筛选出耐ATRA的肝癌PDX模型。结果:敲减Pin1后肝癌细胞Huh7和PLC生长速度明显变慢,将蛋白样品做Western blot检测Pin1蛋白表达降低。继续传代培养,当细胞传至大约到20代的时候,这两株细胞的生长速度恢复正常。通过Western blot检测Pin1蛋白表达水平,发现Pin1蛋白依旧处于敲减状态,Cyclin D1表达恢复。CCK8检测发现Pin1敲减生长恢复后的这两株细胞IC50值变大,预示其对ATRA等Pin1抑制剂产生一定的不敏感。转录组测序最终分析得出生长恢复后的这两株细胞EPHA3的表达水平有升高明显,经q-PCR和Western blot,验证实验结果与转录组测序结果一致,推测EPHA3可能与Pin1敲减细胞生长速度恢复有关。初步构建的耐ATRA肝癌PDX模型中,显示随着ATRA的耐受,Cyclin D1表达有逐渐恢复的趋势。结论:初步分析肝癌对ATRA具有一定的耐药性,其耐受可能与EPHA3上调、及导致Cyclin D1蛋白恢复的通路相关。