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目的:柴油机尾气是指柴油发动机燃烧柴油后喷出的尾气,随着柴油机的广泛应用,柴油机尾气暴露与人体健康的关系越来越受到关注。近年来研究表明,柴油机尾气通过引起氧化损伤、DNA损伤、炎症反应、细胞毒性作用等,严重损害人体健康。叉形头转录因子O亚型(forkhead box type-o3,FOXO3a)是一个重要的抗氧化应激因子,在氧化损伤过程中起着十分重要的作用,但FOXO3a在柴油机尾气所致的氧化损伤中发挥的作用仍不清楚。因此探讨FOXO3a在柴油机尾气有机提取物(organic extracts of diesel exhaust,OEDE)导致损伤效应中的作用就具有十分重要的意义。本研究通过检测OEDE对16HBE细胞造成的氧化损伤,以FOXO3a为切入点,探讨FOXO3a在OEDE导致的细胞毒效应中的作用。方法:1柴油机尾气有机提取物的采集及制备利用气体采样器,通过聚四氟乙烯(PTFE)滤膜收集柴油机尾气颗粒物(diesel exhaust particle,DEP)。二氯甲烷超声,旋转蒸发,用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解完全干燥的提取物。2细胞培养及细胞模型建立人支气管上皮细胞株(16HBE)于含10%胎牛血清的MEM培养基中,37℃、5%CO2饱和湿度下培养。选对数生长期的细胞,用OEDE处理24小时,剂量分别为5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L;以MEM为阴性对照。FOXO3a的表达质粒FOXO3a TM以及靶向沉默FOXO3a的si RNA用于瞬时转染16HBE细胞,经RT-PCR检测FOXO3a表达水平。用剂量为10μg/m L的OEDE处理转染si RNA FOXO3a、转染质粒FOXO3a TM的细胞,分别以转染si RNA control、转染质粒pc DNA3.1为阴性对照。3细胞形态的观察通过倒置显微镜观察OEDE染毒后16HBE细胞形态的改变。4细胞氧化损伤指标的测定将染毒处理后的细胞制成单细胞悬液,孵育2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(2,7-dichlorodihydrf-luorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针,流式细胞仪检测不同剂量OEDE处理16HBE细胞后活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。应用生化试剂盒检测16HBE细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,以及脂质过氧化产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量。5细胞DNA损伤的测定应用单细胞凝胶电泳实验(single cell gel electrophoresis,SCGE),通过Olive尾矩的变化,检测16HBE细胞DNA损伤的程度。6细胞修复能力的测定瞬时转染氯化镉(2μmol/L)受损质粒p GL3-Control和p RL-TK质粒,以不同浓度的OEDE作用16HBE细胞24小时后,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测样品中双荧光素酶的表达情况,以虫荧光素酶和海肾荧光素酶荧光强度的比值来反应DNA修复能力。7细胞蛋白表达水平的测定OEDE处理16HBE细胞后收获,RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,采用Western blot方法检测FOXO3a和磷酸化叉形头转录因子O亚型(phosphorylate forkhead box type-o3,p FOXO3a)蛋白的表达情况。结果:1 OEDE对16HBE细胞形态的影响倒置显微镜下观察发现,正常培养的16HBE细胞形态完整,呈长形,胞质较多,排列较为疏松,贴壁紧密生长,折光率高。染毒处理后,细胞皱缩,胞质减少,排列非常紧密,贴壁能力下降,折光率减弱,有些细胞脱落漂浮于培养液中。说明OEDE对细胞形态有一定程度的影响。2 FOXO3a低、高表达细胞株的鉴定与转染si RNA control的细胞相比,转染si RNA FOXO3a的细胞FOXO3a基因m RNA表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与转染质粒pc DNA 3.1的细胞相比,转染质粒FOXO3a TM的细胞FOXO3a基因m RNA表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明FOXO3a低、高表的细胞株的构建是成功的。3 OEDE对16HBE细胞氧化损伤的影响不同剂量OEDE处理16HBE细胞24h后,随着浓度的增加,ROS水平逐渐升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);SOD和GSH-Px活力逐渐降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);MDA含量逐渐升高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明OEDE可以诱导16HBE细胞氧化损伤,使细胞出现氧化应激。4 OEDE对16HBE细胞DNA的损伤不同剂量OEDE处理16HBE细胞24h后,随着染毒浓度的增加,各剂量组Olive尾矩显著增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);说明OEDE可以诱导细胞DNA损伤。5细胞修复能力的改变随着OEDE浓度的增加,虫荧光素酶和海肾荧光素酶荧光强度的比值逐渐降低,即16HBE细胞DNA的修复能力逐渐下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。说明OEDE抑制细胞DNA的修复能力。6 OEDE对16HBE细胞中FOXO3a和p FOXO3a蛋白表达水平的影响随着OEDE浓度的增加,FOXO3a和p FOXO3a蛋白表达水平在5μg/ml、10μg/ml剂量组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而20μg/ml剂量组表达量明显低于各剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。p FOXO3a和FOXO3a的比值随浓度增加逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。说明OEDE影响FOXO3a与p FOXO3a蛋白表达水平,p FOXO3a发挥主要作用。7调控FOXO3a表达对细胞氧化损伤的影响经OEDE染毒后,FOXO3a低表达细胞MDA、ROS水平升高,SOD、GSH-Px活力降低,OTM值增加,与FOXO3a正常表达细胞相比各值均有明显差异(P<0.05)。而FOXO3a高表达细胞MDA、ROS水平下降,SOD、GSH-Px活力提高,OTM值减小,与FOXO3a正常表达细胞相比各值均有明显差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明FOXO3a发挥抗氧化作用。结论:1 OEDE作用于16HBE细胞,可引起细胞抗氧化功能受损,使细胞出现氧化损伤。2 OEDE可导致16HBE细胞DNA损伤,并使细胞DNA修复能力降低。3 OEDE诱导16HBE细胞的氧化损伤作用,可能与FOXO3a的调节有关。