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莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一种重要的昆虫病原真菌,对鳞翅目夜蛾科害虫的致病力较强,通过引起昆虫种群流行病达到防治效果,是一种良好的真菌杀虫剂。Gα基因编码的Gα蛋白被证明与菌丝形态分化、致病性和次级代谢产物合成等生理活动相关。目前,国内外暂无莱氏野村菌NrGα基因的相关报道。本研究以莱氏野村菌CQNr01菌株Gα基因(NrGα)为研究对象,通过构建Pzp-Ptrpc-Hph-Gα敲除载体,利用农杆菌介导的转化技术,筛选得到ΔNrGα敲除突变菌株。从ΔNrGα生长发育、环境胁迫、微菌核形成、昆虫致病等方面开展研究,明确NrGα基因的具体功能。主要研究结果如下:
①莱氏野村菌NrGα是Ⅰ类Gα亚基
生物信息学分析表明,NrGα开放阅读框长1356bp,编码370个氨基酸,有2个内含子,编码42.6KDa蛋白,不含跨膜结构域,不属于分泌蛋白。同源蛋白序列比对结果显示,NrGα基因含有N-豆蔻酰化位点和ADP核糖基化位点,符合Ⅰ类Gα亚基特点,被鉴定为Ⅰ类Gα亚基。
②缺失NrGα使莱氏野村菌对胁迫环境的耐受性下降
抗逆实验发现ΔNrGα对100μg/mL CFw、100μg/mL CR敏感,除高浓度盐胁迫处理下,敲除菌株在胁迫培养基上均产孢,说明NrGα基因在菌株维持细胞壁完整性、产孢方面起重要作用。微菌核是真菌为抵抗恶劣环境形成的一种休眠体结构。在微菌核诱导实验中,ΔNrGα微菌核数量比野生型减少92.56%,荧光定量结果显示色素基因pks低表达,说明NrGα基因抑制微菌核形成,影响微菌核成核过程、色素沉积过程。
③缺失NrGα使莱氏野村菌对糖类的利用能力下降
NrGα基因不影响胞内cAMP的含量,但缺失NrGα基因导致菌株对糖类的利用能力下降,尤其是对葡萄糖、果糖、海藻糖的利用,说明NrGα的缺失有可能影响了cAMP非依赖性信号途径对糖的利用。
④NrGα正调控莱氏野村菌毒力
毒力实验中,ΔNrGα体内注射、体表侵染存活率分别为92.22%、98.89%,毒力显著下降。其原因可能是NrGα的缺失使虫菌体对海藻糖利用不佳,增殖速率下降,导致ΔNrGα逃避昆虫免疫的能力下降。
⑤转录组差异基因表达分析
对ΔNrGα两型转化时期进行转录组测序,共得到27.07Gb的转录组序列。差异表达基因中,1830个基因上调,有1794个基因下调。其中,极性生长相关基因racA上调表达,细胞壁基因MedA、细胞骨架相关蛋白(α-actinin、Dynein heavy chain)、pH调节相关基因(pH-response regulator protein palA/RIM20)、细胞分裂蛋白Cdc14表达量均下降,说明莱氏野村菌由酵母态向菌丝态转化的过程中,有多个代谢通路联合参与其中。
①莱氏野村菌NrGα是Ⅰ类Gα亚基
生物信息学分析表明,NrGα开放阅读框长1356bp,编码370个氨基酸,有2个内含子,编码42.6KDa蛋白,不含跨膜结构域,不属于分泌蛋白。同源蛋白序列比对结果显示,NrGα基因含有N-豆蔻酰化位点和ADP核糖基化位点,符合Ⅰ类Gα亚基特点,被鉴定为Ⅰ类Gα亚基。
②缺失NrGα使莱氏野村菌对胁迫环境的耐受性下降
抗逆实验发现ΔNrGα对100μg/mL CFw、100μg/mL CR敏感,除高浓度盐胁迫处理下,敲除菌株在胁迫培养基上均产孢,说明NrGα基因在菌株维持细胞壁完整性、产孢方面起重要作用。微菌核是真菌为抵抗恶劣环境形成的一种休眠体结构。在微菌核诱导实验中,ΔNrGα微菌核数量比野生型减少92.56%,荧光定量结果显示色素基因pks低表达,说明NrGα基因抑制微菌核形成,影响微菌核成核过程、色素沉积过程。
③缺失NrGα使莱氏野村菌对糖类的利用能力下降
NrGα基因不影响胞内cAMP的含量,但缺失NrGα基因导致菌株对糖类的利用能力下降,尤其是对葡萄糖、果糖、海藻糖的利用,说明NrGα的缺失有可能影响了cAMP非依赖性信号途径对糖的利用。
④NrGα正调控莱氏野村菌毒力
毒力实验中,ΔNrGα体内注射、体表侵染存活率分别为92.22%、98.89%,毒力显著下降。其原因可能是NrGα的缺失使虫菌体对海藻糖利用不佳,增殖速率下降,导致ΔNrGα逃避昆虫免疫的能力下降。
⑤转录组差异基因表达分析
对ΔNrGα两型转化时期进行转录组测序,共得到27.07Gb的转录组序列。差异表达基因中,1830个基因上调,有1794个基因下调。其中,极性生长相关基因racA上调表达,细胞壁基因MedA、细胞骨架相关蛋白(α-actinin、Dynein heavy chain)、pH调节相关基因(pH-response regulator protein palA/RIM20)、细胞分裂蛋白Cdc14表达量均下降,说明莱氏野村菌由酵母态向菌丝态转化的过程中,有多个代谢通路联合参与其中。