1962年,Ferruccio Ritossa观察到基础体温为25℃的果蝇(drosophila)暴露在37℃高温时,其唾液腺可合成一组相应的蛋白质。后经深入研究发现此组蛋白对细胞功能和内环境的稳定具有广泛的保护作用,因而将这些蛋白质命名为热休克蛋白(heat shock protein,HSP),而将果蝇处于高温时的基因表达和生理保护这一现象称为热休克反应(heat shock response,HSR)。热休克反应,这一所有应激反应中最原始和保守的反应,可诱导合成HSP,作为分子伴侣维持蛋白质的正确折叠状态,保护细胞抵御一系列的应激损伤,包括热休克、缺氧、缺血—再灌注损伤、内毒素、重金属、乙醇等毒性刺激,增强机体细胞对损坏的耐受程度,维持细胞的正常功能代谢,提高细胞生存率,具有强大的保护作用。在应激反应中,HSP基因首先表达,而其他基因的表达则暂时被抑制。在高温、亚砷酸钠、前列腺素-A1诱导的HSR中,HSP的表达可抑制促炎因子的表达,其主要作用是通过抑制某些转录因子来防止过度炎症对细胞的损伤。在哺乳动物细胞中,外界刺激引起多条信号转导通路的激活,其中最重要的是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,MAPKs包括:细胞外信号调节激酶(ERK),c-Jun氮端激酶(JNK),和p38信号通路。酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化引起MAPKs通路的激活,导致下游效应蛋白分子的磷酸化,对外界刺激做出必要的反应。研究发现,通过调节靶基因表达产物,MAPKs信号通路参与感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病理过程以及细胞生长与细胞分化等。MAPKs信号通路持续的激活会导致如自身免疫性疾病、感染性休克、高血压和肿瘤等严重的后果,因此对MAPKs的严密调控为防止这些潜在的严重后果起着非常重要的作用。在哺乳动物细胞中至少有十种丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MAPK phosphatases,MKPs)被鉴定,丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1,MKP-1)是MKP家族中典型的一员。在结构上,它们具有高度保守的碳端催化区域和相对不保守的与MAPKs相衔接的氮端区域。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1,MKP1)又叫双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatases 1,DUSP1),是最早发现特异性作用于MAPK的蛋白磷酸酶。在细胞内主要催化已活化的MAPK家族成员(p38、JNK、ERK)中酪氨酸和苏氨酸磷酸基团的水解,从而抑制其活性,能优先作用于p38和JNK。MKP-1为即早基因编码,生长因子或外界压力使MAPK激活可快速地诱导MKP-1基因的表达,是MKP-1在MAPKs信号转导通路中重要的负反馈调节机制。因此MKP-1基因的表达调控具有重要意义。基因表达的调控包括转录水平、转录后水平与翻译水平等多种层次,其中转录后水平的调控能快速、精确地调控基因的表达而越来越受到大家的重视。生长因子刺激或外界压力下,一些转录因子(Sp1,Sp3和AP-1)从转录水平调控MKP-1基因的表达。然而,MKP-1基因表达的转录后水平的调控知之甚少,尽管MKP-1是即早基因。已有研究表明:转录后调控主要包括mRNA在细胞中的定位、稳定性及其翻译效率,相关的调控元件多位于转录本的非翻译区(untranslated regions,UTR),包括 5’UTR 和 3’UTR,其中尤以 3’UTR 则更为重要。因此,深入研究mRNA 3’UTR调控表达机制将有助于我们更好的揭示机体生命活动的奥秘。大量的研究表明:RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一类在生物进化过程中高度保守并在生物体内广泛存在的蛋白,它通过其特定的RNA结合结构域特异性地与靶RNA的特异结构或序列结合,直接或间接地参与了pre-mRNA的剪切、编辑、运输、稳定性保持和降解、翻译等过程。人抗原R(human antigen R,HuR)就是其中的一种RNA结合蛋白,在许多细胞中普遍表达,是人类胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)家族中惟一广泛表达的一种蛋白,可以结合并稳定在3’UTR中的AU富集区(AU-rich region,ARR),与顺式反应元件一起调节mRNA的稳定性,提高蛋白质的表达水平。ELAV家族最初在果蝇中被发现,包括HuR、HuB、HuC和HuD。它们在细胞中主要通过基因的转录后调控机制来调节靶基因的表达,其中HuR基因在哺乳动物细胞中广泛表达,而后三者仅在神经系统中表达。HuR是一种在机体各组织中广泛表达的重要RNA结合蛋白,其通过调控靶mRNA的稳定性和(或)翻译效率来影响靶基因在细胞中的表达水平,从而参与细胞生命活动的调控。近年来的研究揭示:HuR蛋白是细胞分裂、细胞衰老、免疫细胞激活及肌肉分化等生命活动的重要调控因子,其功能异常与炎症、肿瘤等疾病的发生发展密切相关。mRNA稳定性是调控真核细胞基因表达的重要机制之一,属于基因的转录后调控,可影响蛋白质的翻译效率。人类HuR基因定位在染色体的19p13.2区,编码的成熟mRNA全长996 nt,蛋白质分子量约为36 kDa。HuR蛋白含有3个RNA识别模体(RNA recognition motif,RRM)结构域,其中N端的RRM1与RRM2参与同靶mRNA分子的结合。HuR蛋白可特异性地结合靶mRNA3’UTR中的ARE元件(AU rich element),通过提高靶mRNA的稳定性和(或)翻译效率而上调靶基因在细胞中的表达水平。但近年来的研究表明,HuR蛋白在细胞中同样可以负调控靶基因的表达,如HuR可特异性地结合到p27Kip1 mRNA的5’UTR序列中的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),抑制p27Kip1蛋白质的翻译。HuR的核质穿梭对于它自身的活性来说是必要的。正常情况下,HuR主要表达在细胞核,但在多种条件如炎性因子刺激、低氧、放射治疗、化疗和免疫治疗等刺激下,可通过RRMs与mRNA 3’UTRAREs和其他反式作用因子结合,从细胞核转运到细胞质,并结合多种参与肿瘤生长、凋亡抵抗、化疗耐药、血管生成和淋巴管生成相关因子mRNA,并改变RNA的空间结构从而抑制脱腺苷化、抑制mRNA募集至外切酶体或阻断可识别AREs的核酸内切酶活性,继而增强mRNA的稳定性,提高蛋白质表达,最终促进肿瘤进展。HuR蛋白在细胞中的功能与定位还受到磷酸化修饰的影响,活化的p38 MAPK可催化HuR 118位苏氨酸(HuR Thr118)的磷酸化,使其由细胞核快速移位至细胞浆,提高靶向mRNA的稳定性。而当细胞受到H202刺激时,CHK2激酶被激活后可催化HuR蛋白第88位丝氨酸(serine 88,Ser88)、Ser1 00与Thr1 18的磷酸化修饰,从而影响其与SIRT1 mRNA分子的结合。有研究报道了 CHK2激酶还可通过催化HuR蛋白Thr118的磷酸化修饰来提高其在细胞中的稳定性。此外,HuR蛋白的202位丝氨酸被CDK1激酶磷酸化修饰还能促使其与14-3-3蛋白相互结合,从而滞留在细胞核中。PKCα可催化HuR蛋白Ser221的磷酸化修饰,这对于细胞在受到ATP刺激时HuR由细胞核移位至细胞浆至关重要。综上所述,我们认为通过对MKP-1 mRNA3’UTR功能的初步研究和与其相互作用的RNA结合蛋白HuR的功能研究,有助于揭示MKP-1基因表达转录后调控机制,促进我们对MAPKs信号通路调控机制的进一步了解。在本研究中,我们首先检测了在热休克(43℃,5%C02)刺激下MKP-1 mRNA的稳定性,其次相同条件下检测MKP-1蛋白变化,发现MKP-1 mRNA以及蛋白的稳定性上调了。在上述实验的基础上,我们进一步采用了Biotin RNA-pull down技术鉴定了HuR能与MKP-1 mRNA相互作用。我们首先通过体外转录的方法合成了生物素标记的MKP-1 mRNA 3’UTR的RNA探针,将其与热休克刺激或不刺激的MEF细胞的裂解液共孵育,通过Western blotting在热休克刺激组检测出了HuR蛋白,在对照组却没有检测到HuR蛋白。同时为验证在这一过程中是否有p38信号通路的参与,将p38干扰后进行实时定量PCR检测,发现MKP-1 mRNA明显下调了。最后我们对HuR的生物学功能做了进一步的研究。结果显示,热休克刺激下HuR蛋白明显磷酸化,且MKP-1蛋白表达上调,提示HuR可能通过p38信号通路来实现对MKP-1 mRNA的调控。同时,我们分别在正常的MEF细胞以及敲除p38基因的MEF细胞中进行MKP-1 mRNA和MKP-1蛋白半衰期检测,且对HuR以及其突变体于热休克刺激下在这两种细胞中进行了定位检测。发现敲除p38基因的MEF细胞中MKP-1 mRNA和MKP-1蛋白半衰期与正常组相比均明显缩短。总之,我们通过以上实验发现在热休克刺激下HuR对MKP-1 mRNA存在正调控作用,HuR的118苏氨酸被p38 MAPKs磷酸化,且HuR从细胞核移到了细胞浆形成应激小体。本研究取得的实验结果:1.热休克后检测MKP-1 mRNA和其蛋白半衰期,发现刺激后MKP-1 mRNA和其蛋白半衰期明显延长。2.分别在正常的MEF细胞(p38+/+)以及敲除p38基因(p38-/-)的MEF细胞中检测MKP-1 mRNA和MKP-1蛋白半衰期改变,发现p38-/-MEF细胞中MKP-1 mRNA和MKP-1蛋白半衰期均明显缩短了。3.p38信号通路被抑制后MKP-1 mRNA表达明显下调。4.转染HuR后MKP-1 mRNA和其蛋白半衰期明显延长。5.采用Biotin RNA-pull down方法验证了MKP-1 mRNA与HuR存在相互作用。6.热休克后HuR 氨酸被明显磷酸化。7.免疫荧光检测HuR在细胞中的定位。