研究目的干扰素(Interferons, IFNs)是机体内一种重要免疫炎症介质,具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤和免疫调节的作用。IFNs通过JAK-STAT信号通路激活信号转导转录活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)进而启动目标基因的转录。大量的研究证明,异常的IFNs信号会导致各种免疫性疾病的发生,目前调控IFNs信号的分子机制仍然不清楚。Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulation factor1, Smurfl)是一种HECT型泛素连接酶,可以介导多种蛋白的泛素化降解。作为Smadl相互结合蛋白,Smurfl在1999年首次被发现,随后的研究发现Smurf1可以通过介导Smad1/5、TGF-βR、RhoA、MEKK2、Rrickle1、 JunB等多种信号分子的泛素化降解来调节转化生长因子β(Transforming growth factor, TGF-β)信号通路。虽然Smurfl在TGF-β信号通路中的作用已经被很好的阐释,但是Smurfl在其他信号通路尤其是在免疫反应中的作用还不清楚。最近有两篇文献报道了Smurfl在免疫系统中的作用：Smurfl可以介导在免疫反应中起重要作用的TRAFs发生泛素化降解；Smurfl与Smurf2、Smad6形成一个复合物,通过介导髓样分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)的泛素化降解负向调节Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路。为了研究Smurfl在免疫反应中的作用,我们探讨了Smurfl对IFNs信号通路的影响,并阐述了其分子机制。研究方法1.利用Smurfl过表达质粒转染小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,通过双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase reporter assay system, DLR)的方法检测Smurfl对IFN-y诱导GAS-luc报告基因活化的影响,以及Smurfl对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS;也被称作Nos2)启动子活性的影响。2.利用Smurfl特异性的siRNA转染小鼠原代腹腔巨噬细胞,通过荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法检测Smurfl对(?)Jos2、Irf1、 Cxcl9、Cxcl10、Ly6e、Ifi203等IFNs目标基因表达的影响。3.利用免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光(IF)等技术研究Smurfl(?)(?)STAT1的相互作用；利用Smurfl的截断突变体和STAT1的点突变体寻找介导Smurfl和STAT1发生相互作用的结构域或基序。4.利用质粒共转染和体内泛素化实验探讨Smurfl对STAT1蛋白水平及泛素化水平的影响；利用STAT1的磷酸化位点突变体探讨Smurfl介导STAT1泛素化与STAT1磷酸化的关系。5.利用病毒感染及病毒空斑实验研究Smurfl在IFN-y介导的抗病毒免疫反应中的作用。6.分别用IFN-y和IFN-p刺激RAW264.7、(?)鼠原代腹腔巨噬细胞、NIH3T3. HEK293等不同细胞,通过Western blot的方法检测IFNs对Smurfl表达的影响。结果1. Smurfl负向调控IFNs信号为了研究Smurfl在免疫反应巾的作用,我们首先探讨了Smurfl对IFNs信号的影响。为了研究Smurfl对IFNs信号的影响,我们先检测了Smurfl过表达对IFN-γ诱导的GAS-luc(?)(?)告基因的影响。通过双荧光素酶报告基因实验,我们发现：高表达Smurfl能显著的抑制IFN-y诱导的GAS-luc(?)(?)告基因的活性,而且这种抑制作用随着Smurfl表达量的增加而更加显著。同时,我们还检测了Smurfl对IFN-γ目标基因iNOS启动了活性的影响,Smurfl同样可以显著的抑制iNOS启动了报告基因的活性。为了更加直接的研究Smurfl对IFN-γ诱导基因表达的影响,我们利用Smurfl特异性的siRNA沉默小鼠原代腹腔巨噬细胞中Smurfl的表达,然后通过qRT-PCR检测IFN-y目标基因的表达。我们发现：当Smurfl被沉默之后,IFN-y诱导的Nos2、Irf1、Cxcl9和Cxc110的表达都显著升高。与之类似,当Smurfl被沉默之后,IFN-β诱导的Cxcl9、Cxcll1、Ly6e和Ifi203的表达也都显著增强。这些结果提示我们：Smurfl可以负向调节IFNs信号通路。2. Smurfl可以与STAT1发生组成性结合Smurfl可以同时抑制IFN-β信号和IFN-y信号,而IFN-β信号和IFN-γ信号下游一个重要的共同分子就是STAT1。而且,之前的相互作用组学研究预测了Smurfl和STAT1可以相互结合。因此,我们提出假设：Smurfl通过靶向STAT1进而负向调节IFNs信号。为了证实Smurfl与STAT1可以发生相互作用,我们将Smurfl和STAT1的过表达质粒转入HEK293细胞中,然后分别用相应的抗体做Co-IP和Western Blot。结果发现：外源性的Smurfl和STAT1可以发生相互结合。然后,我们在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中证实：内源性的Smurfl可以不依赖于IFNs的刺激与内源性的STAT1发生组成性的结合。之前大量的研究报道了Smurfl主要是通过其WW结构域与底物蛋白富含脯氨酸的PY基序发生相互结合。为了寻找Smurfl中介导其与STAT1发生相互结合的结构域,我们将Smurfl的各种截断突变体与全长STAT1质粒共转染入HEK293中,Co-IP和Western Blot的实验结果发现：Smurfl通过其WW结构域与STAT1的发生相互结合。对STAT1的氨基酸序列进行分析,我们发现STAT1的663位至666位氨基酸序列为PLKY,形成了潜在的PY基序。为了确定STAT1是否是通过其PY基序与Smurfl发生相互结合的,我们构建了PY基序突变体,并将其与Smurfl过表达质粒共转染HEK293。Co-IP和Western Blot的实验结果发现：PY基序发生突变的STAT1失去了与Smurfl结合的能力。这些结果提示我们:Smurfl可以通过WW结构域与STAT1的PY基序发生组成性的结合。3. Smurfl介导STAT1的泛素化降解Smurfl是一种可以介导多种分了发生泛素化降解的泛素连接酶,而且Smurfl可以与STAT1发生相互结合的,这就促使我们去研究Smurfl对STAT1降解的影响。我们将STAT1过表达质粒与不同量的Smurfl野生型过表达质粒或Smurfl泛素连接酶活性位点突变体质粒共转染入HEK293细胞中,Western Blot检测发现：野生型Smurfl过表达可以显著降低STAT1的蛋白水平,而Smurfl泛素连接酶活性位点突变体对STAT1的蛋白水平没有影响。与之类似,Smurfl过表达可以显著降低内源性STAT1的蛋白水平。为了在生理条件下研究Smurfl对STAT1的影响,我们利用Smurfl特异性的siRNA将小鼠原代腹腔巨噬细胞巾Smurfl沉默,Western Blot检测发现：转染Smurfl特异性siRNA组的STAT1蛋白水平明显比转染阴性对照siRNA组高。这些结果提示我们：Smurfl可以影响STAT1的蛋白水平,而且这种影响与其泛素连接酶活性有关。Smurfl作为一种泛素连接酶可以降低STAT1的蛋白水平,因此,我们提出假设：Smurfl可以介导STAT1发生泛素化降解。为了验证我们的假设,我们首先利用体内泛素化实验检测了Smurfl对STAT1泛素化的影响。我们发现：在野生型Smurfl存在的情况下,STAT1的泛素化水平明显升高,而Smurfl泛素连接酶活性位点突变体对STAT1的泛素化水平没有影响。大量研究表明：不同的蛋白分了可以发生不同形式的泛素化,而泛素化的形式决定了蛋白分了不同的命运。接下来,我们利用泛素突变体和体内泛素化实验研究了Smurfl介导STAT1发生泛素化的形式。实验结果表明:Smurfl可以显著增加STAT1K48位的聚泛素化,而对STAT1K63位聚泛素化没有影响。之前的研究表明：发生K48位聚泛素化的蛋白可以被26S蛋白酶体所识别并降解。与之一致,我们发现26S蛋白酶体抑制剂MG132可以消除Smurfl对STAT1蛋白水平的影响。这些实验结果证明：Smurfl可以介导STAT1发生K48位的聚泛素化,并被26s蛋白酶体识别降解。4. Smurfl介导STAT1的泛素化不依赖于STAT1的磷酸化STAT1的Tyr701和Ser727磷酸化对于STAT1发挥其转录激活作用起着非常重要的作用。之前有研究报道,泛素连接酶SLIM介导STAT1泛素化降解依赖(?)STAT1的磷酸化。Smurfl介导STAT1的泛素化是否依赖于STAT1的磷酸化呢?为了回答这个问题,我们构建了STAT1磷酸化位点突变体,将其与不同量的Smurfl过表达质粒共转染入HEK293细胞,Western Blot检测结果发现：过表达Smurfl可以降低野生型STAT1和STAT1磷酸化位点突变体的蛋白水平。与之一致,体内泛素化实验结果社示：过表达Smurfl可以增加野生型STAT1和¨STAT1磷酸化位点突变体泛素化水平。这些实验结果证明：Smurfl介导STAT1发生泛素化降解不依赖于STAT1的磷酸化。5. Smurfl负向调节抗病毒免疫反应IFNs对于机体抵抗病毒感染发挥着非常重要的作用,而Smurfl是IFNs信号的一种抑制因子。因此,我们推测Smurfl可能会在机体抵抗病毒感染的过程中发挥一定的作用。为了探讨Smurfl对IFN-y介导的抗病毒反应的影响,我们用VSV病毒感染高表达Smurfl的HEK293细胞和沉默Smurfl的小鼠原代腹腔巨噬细胞,然后利用病毒空斑实验和实时定量PCR检测病毒的复制情况。病毒空斑实验表明：转染野生型Smurfl组细胞上清巾病毒滴度明显高于转染空质粒组,而转染Smurfl泛素连接酶活性位点突变体组细胞上清巾病毒滴度相对于空质粒组没有明显变化。同样的,转染野生型Smurfl的HEK293细胞中VSV的RNA复制数明显高于转染空质粒和泛素连接酶活性位点突变体组。为了进一步验证Smurfl在生理情况下的抗病毒作用,我们用Smurfl特异性的siRNA转染小鼠原代腹腔巨噬细胞并用IFN-γ刺激,然后用VSV病毒感染。病毒空斑实验表明,沉默Smurfl的表达显著降低了巨噬细胞上清巾的病毒滴度。qRT-PCR的结果同样表明,沉默Smurfl的表达显著降低了巨噬细胞内VSV的RNA复制数。这些结果提示我们：Smurfl可以负向调节细胞的抗病毒免疫反应。6. IFN-y诱导Smurfl的表达前面实验研究了Smurfl对IFNs信号的影响,接下来我们探讨IFNs对Smurfl表达的影响。我们用IFN-β、IFN-y刺激RAW264.7、小鼠原代腹腔巨噬细胞、NIH3T3、HEK293等不同细胞,通过Vestern blot的方法检测IFNs对Smurfl表达的影响。实验结果表明：IFN-γ可以在RAW264.7.小鼠原代腹腔巨噬细胞、NIH3T3、HEK293等多种细胞中诱导Smurfl的表达,而IFN-β对无法诱导Smurfl的表达。结论1.泛素连接酶Smurfl可以通过介导STAT1的泛素化降解负向调控IFNs信号。2. Smurfl可以通过其WW结构域和STAT1的PY基序与STAT1组成性结合,进而介导STAT1发生K48位的聚泛素化,并被26S蛋白酶体识别降解。3. Smurfl可以负向调节细胞的抗病毒免疫反应。4. IFN-y可以诱导Smurfl的表达,Smurfl形成一种反馈调节机制调控IFN-γ信号转导。创新性和意义1.本研究首次发现了HECT型泛素连接酶Smurfl可以负向调节IFNs信号通路,丰富了我们对Smurfl在免疫反应中的作用的理解。2.在本研究中,我们阐明了Smurfl抑制IFNs信号的一种可能的分了机制。我们明确了STATl作为一个新的靶点,可以被Smurfl识别并发生泛素化。这个发现拓宽了Smurfl的底物谱,同时也证明了机体中除了SLIM存在另一种泛素连接酶可以介导STAT1发生泛素化。3.之前的研究发现由SLIM介导的STAT1泛素化依赖于STAT1磷酸化,有趣的是我们发现STAT1的磷酸化对Smurfl介导STAT1泛素化并不是必须的,因此Smurfl可能是STAT1在整体水平上的一种调节因子。4.本研究发现IFN-y可以诱导Smurfl的表达,Smurfl进而通过介导STAT1的泛素化降解来负向调节IFN-y信号,揭示了一种新的IFN-y信号负反馈调节机制。局限性1.本研究虽然发现了Smurfl可以介导STAT1发生泛素化降解,但是没能明确STAT1的泛素化位点。2. IFNs不仅具有抵抗病毒复制作用,其在免疫调节方面也具有非常重要的功能,Smurfl是否通过影响IFNs信号参与免疫调节,这需要进一步的研究。