目的ROR2是Wnt非经典通路的重要受体，在进化过程中高度保守，在胚胎生长发育和成体机能维持中发挥了重要作用，ROR2突变沉默个体会产生普遍性肢体、脊柱、面部等骨骼发育不良。有研究表明：ROR2在多种肿瘤中的表达情况和发挥的功能均不同。在有些肿瘤中，ROR2介导Wnt非经典通路，拮抗Wnt经典通路，发挥抑癌因子作用，如在结直肠癌；但在有些肿瘤中，ROR2介导Wnt经典通路，发挥致癌作用，如在黑色素瘤。近年来，国外和我们的研究发现，Wnt5a在白血病中的抑癌作用可能是由ROR2介导完成的。前期研究中发现，Wnt5a启动子异常甲基化现象普遍存在于在多种白血病病例中，治疗缓解后，Wnt5a表达恢复，表明Wnt5a在白血病中可能具有抑癌作用。Wnt5a能够抑制β-catenin及下游靶基因表达，从而增强慢粒细胞株对伊马替尼的敏感性。我们在机制研究中还发现，外源性Wnt5a能够上调K562细胞中ROR2受体表达并与之结合，进而抑制TCF/LEF转录活性和其下游靶基因cyclinD1表达，提示Wnt5a是通过Wnt5a/ROR2转导信号、拮抗-catenin的作用，抑制Wnt经典信号途径，发挥抑癌功能。但ROR2在白血病中能够发挥怎样的功能，是否也能对骨髓间充质干细胞、造血微环境产生影响？目前国内外还未见报道。本研究以慢性粒细胞白血病细胞株K562为模型，采用Westernblot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光和RNA干扰等技术，构建了多个质粒表达系统和改良腺病毒感染技术，并围绕ROR2在白血病细胞和间充质干细胞为主的微环境中发挥抑癌作用的效应和机制进行研究。研究发现ROR2在白血病中能够发挥肿瘤抑制作用，其机制包括形成周期阻滞抑制肿瘤增殖，通过激活非经典Wnt信号：JNK通路，启动凋亡信号，促进肿瘤细胞凋亡；ROR2能够诱导K562细胞凋亡，其抑癌作用与Wnt5a的抑癌作用有区别；ROR2可作用于骨髓微环境中主要成分——间充质干细胞，影响其细胞因子的分泌，调控其与白血病细胞间的相互作用。近年来，PiggyBac (PB)转座子系统的研究不断完善和进步，具备了诸多优势，已成为哺乳动物细胞转基因技术中备受关注的技术之一。我们利用这一系统，构建了多个基因表达载体和改造细胞，为研究提供了有力技术支持。其次，PB系统以往多用于基因表达体系的构建，罕见用于基因的稳定沉默、敲降系统，我们利用PB转座子系统设计并构建了一种稳定基因沉默系统，并在间充质干细胞中进行了效应验证，为PB转座子的应用拓展了新的方向，为基因功能研究提供了良好的工具。我们以往研究发现：用腺病毒作载体向白血病细胞中转基因时，腺病毒感染效率极低。本研究中，我们通过改进技术，改良腺病毒感染体系，显著提高了腺病毒感染效率，为研究提供了可靠保证，也提高了腺病毒系统在更多研究中的适用性。总之，该研究在前期工作基础上，进一步探讨了Wnt非经典途径的重要受体ROR2在慢性粒细胞白血病中可能具有的抑癌效应和作用机制，研究的结果有望丰富Wnt信号与肿瘤发生的相关理论，为寻找白血病治疗靶点、研发抗白血病的非细胞毒性药物或小分子化合物提供有力的科学依据。方法1. ROR2在白血病中的表达和作用机制研究1.1Westernblot和免疫组化法检测临床病例中ROR2的表达1.2分子克隆技术构建ROR2表达质粒和AdROR2腺病毒表达体系1.3流式细胞术、荧光素酶报告实验、ALP染色、荧光计数法证实Polybrene的联用与腺病毒感染效率的关系1.4CCK-8法检测ROR2对白血病细胞K562的增殖影响1.5流式细胞术检测ROR2对K562细胞周期的影响1.6Westernblot检测ROR2对K562细胞JNK通路和MMP9蛋白表达的影响1.7AnnexinV-EGFP、PI和Hoechst33342联用法检测ROR2、Wnt5a对K562细胞凋亡的影响1.8动物实验观察ROR2在K562细胞中抑癌作用的体内效应2.间充质干细胞高表达ROR2对K562细胞的作用2.1构建稳定高表达ROR2的iMEFs间充质干细胞iMEFs-ROR2-luc及对照株2.2构建稳定表达RFP的K562-RFP细胞株2.3构建非接触共培养体系和接触培养体系2.4荧光计数和形态学观察高表达ROR2后K562细胞的变化2.5流式细胞术检测K562细胞在共培养体系中的增殖情况2.6RT-PCR法检测高表达ROR2后对iMEFs细胞基因表达的影响3. PiggyBac系统构建的稳定敲降系统pMPBOS在间充质干细胞中的应用3.1以PiggyBac系统为载体，利用分子克隆手段，构建pMPBOS系统3.2以pMPBOS系统为基础，利用分子克隆手段连入小鼠-catenin siRNA序列，构建稳定敲降-catenin的pMPBOS--catenin体系，并通过脂质体转染技术，构建稳定敲降-catenin的间充质干细胞iMEFs-KDn3.3荧光素酶报告实验、ALP相对活性测定、RT-PCR、免疫荧光等方法证明pMPBOS的稳定性和有效性结果1.急/慢性白血病初诊病人骨髓中ROR2低表达或不表达，治疗达完全缓解的病人ROR2表达升高。2.与对照株相比，稳定高表达ROR2的K562细胞K562-ROR2-luc无法正常生长，提示ROR2对白血病细胞生长有抑制作用。3.外源性高表达的ROR2能够抑制K562细胞增殖，将细胞阻滞在G2期，增加细胞凋亡率。4.外源性ROR2能够激活K562细胞的JNK途径磷酸化，激活凋亡信号。5.间充质干细胞iMEFs与K562细胞接触共培养，能够促进细胞发生形变、迁移进入间充质细胞间隙。6.高表达ROR2的微环境能够减少K562细胞发生形变、进入间隙的比例。7.外源性高表达ROR2改变了iMEFs细胞中c-Jun，CTGF，Pecam-1，L-selectin，E-Cadherin，LIF，Vcam-1和FOXO-1的mRNA表达水平，从而改变间充质干细胞和白血病细胞之间的相互作用。8.在与Polybrene联用条件下，C2C12细胞株和iMEFs细胞株的腺病毒感染率在一定范围内存在剂量依赖现象。9. Polybrene能够显著增强AdBMP9腺病毒在iMEFs中的成骨效应。10.联用Polybrene能够显著提高腺病毒在K562细胞中的感染效率。11.构建了以PiggyBac系统为基础的pMPBOS稳定敲降转座子系统，能够实现单基因或多基因的一步法稳定敲降。12.构建了稳定敲降小鼠β-catenin的表达质粒pMPB-β-catenin，并利用该质粒构建了稳定敲降β-catenin的iMEFs细胞(iMEFs-KDn)。13.细胞实验证实，pMPBOS系统存在量效依赖关系，且能够影响β-catenin下游信号通路和远期生物学效应。结论1. ROR2在白血病病人骨髓中低表达或不表达，在治疗缓解后表达升高；ROR2稳定表达的K562不能正常增殖或存活，提示ROR2对K562细胞有抑癌效应；ROR2能够抑制K562在体内和体外的增殖，将其阻滞在G2期，并诱导该细胞凋亡，其机制可能与ROR2促进了p-JNK1/2表达，激活了JNK途径，启动了凋亡信号有关，促凋亡效果优于Wnt5a；2.高表达ROR2的接触共培养体系中，白血病细胞迁移入iMEFs细胞间隙的数量减少，细胞间粘附作用减弱，不能形成致密的混合细胞微球，而是形成松散、弥漫纤细的“带状”克隆。ROR2改变了iMEFs细胞中与粘附相关的部分基因表达，如下调了Pecam-1、L-selectin、E-Cadherin、LIF、Vcam-1和FOXO-1，上调了c-Jun和CTGF基因表达。提示ROR2可能通过调控iMEFs细胞的粘附功能，使白血病细胞定植能力降低，具体的机制有待进一步研究。3.阳离子聚合物凝聚胺，即Polybrene，是一种安全、有效、价廉物美的增效剂，通过优化技术方案，将之应用于腺病毒转基因系统，有效提高了感染效率，特别是对常规方法转基因不佳的血液细胞，明显提高了其转基因效率，简便易行，效果显著。4.基于PiggyBac系统构建的pMPBOS系统能够实现长期、高效的稳定敲降目的基因的功能，通过构建稳定细胞株实现单基因或多基因的一步法稳定敲降，在间充质干细胞iMEFs中有效敲降了Wnt关键分子-catenin的表达和作用，充分证实了该系统的有效性，为基因功能研究提供了有效的生物学技术。