研究背景：肝脏是人体最重要的器官之一,它对人类的生存是不可或缺的。肝脏在能量代谢、消化吸收、解毒、红细胞的分解与清除、生化物质比如血浆蛋白、激素等的合成和降解很多方面发挥着重要的作用。由于其在机体的不可替代的战略性地位和它的多方面功能,肝脏与其他脏器相比也就更易于罹患多种疾病。其中包括病毒性肝炎,黄曲霉素B1中毒,酒精损伤,脂肪肝,肝硬化,肿瘤,药物损害。其中原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是由以上各种慢性肝脏疾病所导致的的最严重的临床转归。HCC直接威胁到人类健康和生命。原发性肝细胞性肝癌是最常见的原发恶性肿瘤之一,严重危害人类的身体健康。它恶性程度高,进展快,预后差,侵袭性强。全球每年约有50至100万的新增病例,死亡患者接近六十万人。全世界肝癌发病率占肿瘤发病率的第五位,而病死率仅次于肺癌、胃癌,位居肿瘤相关死亡的第三位。其中约有80%的HCC患者发生于亚洲太平洋地区和南部非洲等地的发展中国家,这些地方同时又是病毒性肝炎的高发区。近年来,由于丙型肝炎病毒(HCV)感染的增加,HCC在西方社会的发病率正在逐年上升。中国目前每年新发肝癌约三十六万例,死亡超过三十三万人,占我国癌症发病率第三位和肿瘤相关死亡的第二位。HCC的发病是多因素、多步骤的复杂过程,受环境和遗传双重因素影响。流行病学及实验研究资料已表明乙型肝炎病毒(HBV)和HCV感染、黄曲霉毒素B1、酒精、肝硬化及性激素等与HCC发病相关。其中,HBV与HCV感染是最重要的因素,80%的HCC与HBV或/和HCV的慢性感染有关。同时85%的HCC的患者合并肝硬化。这些不同背景的慢性肝脏疾病在疾病的发生、发展及转归也各有其特点。它们分别具有不同的遗传、外在变化,包括不同的染色体异常、基因突变及不同的信号分子变化等。最近的研究发现,新陈代谢的失调,特别是脂代谢紊乱是慢性肝病导致HCC的主要诱因之一。bHLH(Basic helix-loop-helix)蛋白是一类具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子,该家族成员可通过HLH结构域相互作用形成同源或异源二聚体,并由HLH结构区的氨基端的碱性区识别并结合细胞类型特异性基因启动子或增强子中的E-box位点,从而调节这些基因的转录。由此bHLH蛋白在细胞分化、发育、增殖及肿瘤发生过程中发挥关键作用。DEC1 (Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1)蛋白具有bHLH结构域,属于bHLH类转录因子家族成员。它在机体各种生理功能中发挥重要的作用,比如细胞分化、增殖、凋亡、缺氧反应、免疫耐受和肿瘤形成。作为主要的时钟调节分子,DEC1与DEC2一起组成第五个时钟基因家族。它们与CLOCK、BMAL1、PER和CRY一起参与调节细胞内水平的生物周期节律。近年来DEC1在物质能量代谢和维持机体稳态方面的作用正在逐步被我们所认识。DEC1在机体多层面、多角度、多阶段的不同作用预示着它可能位于机体调节的焦点位置；联系各种功能、整合多种变化从而保持机体的稳态。在肿瘤的发生、发展过程中,DEC1的作用有组织细胞类别的特异性,在组织类型不同,起源不同的肿瘤中和肿瘤发展的不同阶段,DEC1具有不同的表达模式,可能扮演者不同的角色：在乳腺癌中,高表达的DEC1与肿瘤的高侵袭性相关；在胃癌中,DEC1在分化差,恶性程度高的患者中表达增加；与癌旁组织相比较,结肠癌组织中高表达DEC1; DEC1参与介导由UVB导致皮肤癌的信号传导过程；而在肺癌中,DEC1的表达的报道存在相反的两种结论。DEC1与肿瘤发生发展关系的研究尚处于起步阶段,具体作用机制尚不明确。DEC1作为癌基因或是抑癌基因,在不同来源的肿瘤及肿瘤发展的不同阶段所起的作用还需要进一步的研究和归纳。在肝脏中,已有研究发现,DEC1参与肝细胞的生物周期节律调节、新陈代谢的维护和再生性控制等各方面的调控。但是DEC1在肝脏疾病,特别是HCC形成中的作用还不清楚。到目前为止,还未见到原发性肝癌与DEC1关系的系统研究报道。为了探讨DEC1在原发性肝细胞性肝癌发生、发展中所起的作用。我们对DEC1在肝癌细胞、组织中的表达及其与原发性肝癌发生发展的关系进行了研究。目的：研究DEC1与原发性肝癌发生发展的关系,探讨其在原发性肝癌发病机制中的作用和意义。方法和步骤：研究对象：组织标本取自山东大学附属千佛山医院和济南市中心医院病理科,于2006年1月至2009年5月期间手术切除并经病理证实。176例肝组织标本包括126例来自于63例肝癌患者的癌组织及与其相对应的癌旁组织,50例正常肝组织标本来自于肝血管瘤患者的手术切除组织。所有的患者手术前均未接受过放射性治疗或化疗等抗肿瘤治疗。血管瘤患者根据病毒学指标检查均无病毒感染。63例肝细胞性肝癌患者中男52例,女11例。年龄35-77岁,中位数年龄56岁。50例血管瘤患者中男17例,女33例。标本的选取是随机的,并经过了当地伦理委员会的批准。63例肝癌患者的病理分级包括：高分化18例,中、低分化45例。收集患者的性别、年龄、肿瘤大小、HBV感染情况、是否伴随肝硬化和AFP水平等临床相关参数进行分析。随机选取12例乳腺癌标本和5例肺癌标本作为对照。12例乳腺癌根据组织学分级包括：Ⅰ级3例,Ⅱ级7例,Ⅲ级2例。5例肺癌包括2例腺癌和3例鳞癌。人肝癌细胞株：SMMC-7721,HepG-2,Bel-7402,Hep-3B细胞由本室传代培养保存；人正常肝上皮细胞株HL一7702由山东大学医学院免疫教研室馈赠。RT-PCR法检测肝癌细胞中DEC1mRNA的表达：利用TRizol法分别提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DEC1mRNA在肝癌细胞和正常肝上皮细胞的表达情况。逆转录反应按照既定的反应体系进行逆转录。反应条件：50℃30min,99℃5min,5℃5min.PCR反应在PCR仪中扩增,DEC1基因的PCR引物序列：上游：5’-gtaccctgcccacatgtac-3’下游:5’-gcttggccagatactgaagc-3’扩增片段长度为395bp,反应条件为：94℃20 sec,56℃20sec,72℃20sec共35个循环。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。流式细胞术检测肝癌细胞DEC1的表达：应用流式的方法初步检测肝癌细胞株Be1-7402中DEC1蛋白的表达情况。Bel-7402细胞中加入抗DEC1多克隆抗体,37℃摇床上孵育90分钟。PBS缓冲液清洗后,加入FITC标记的二抗,室温孵育25分钟。1%多聚甲醛固定后,上机(FACSCalibur flow cytometry)检测。荧光标记物测定时,同时设立阴性对照管。细胞免疫化学方法检测DEC1蛋白在肝癌细胞的表达及亚细胞定位：人正常肝上皮细胞株HL-7702,肝癌细胞株HepG-2、Bel-7402分别传代后培养24小时,检测DEC1的表达和亚细胞定位。为避免肝细胞中内源性生物素的干扰,采用非生物素标记的免疫组化试剂盒(KIT-5010, Max Vision, Maixin.Bio, China)。棕色颗粒沉着代表DEC1蛋白表达阳性。肝组织中内源性生物素对免疫组织化学结果的干扰现象：在检测肝癌组织中STAT5a的表达时,分别以生物素标记和非生物素标记的二抗对同一来源的肝组织切片进行免疫组化测定。检测肝组织细胞中内源性生物素在肝组织免疫组化中的的干扰作用。评价肝组织细胞中内源性生物素对肝组织免疫组化的干扰状况,从而选择特异性强的免疫组化方法和试剂。免疫组织化学方法检测肝组织中DEC1的表达：免疫组化方法检测DEC1蛋白在肝癌组织及其癌旁组织的表达情况,分析DEC1的表达与肝癌分化程度的相关性,及与肝癌临床病理参数间的关系。将甲醛固定、石蜡包埋的标本于切片机上切取4μm厚的组织切片,放入60℃电热恒温培养箱中60 min。依次进行脱蜡、水化处理。将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液(PH6.8)的耐热容器中,放入高压锅内煮沸3分钟进行抗原修复。3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶。加入抗DEC1多克隆抗体,4℃湿盒过夜。二抗为非生物素标记(KIT-5010, Max Vision, Maixin.Bio, China)。DAB显色5分钟,苏木素复染,透明、封片。乳腺癌组织切片作为阳性对照,以PBS液代替一抗作为阴性对照。结果通过双盲法由两位有经验的病理专家独立评估。取结果一致的标本进行统计学分析。统计学处理：采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析。分类变量用卡方检验和Fisher校正检验分析。DEC1表达量与肝癌分化程度之间的相关性则采用Spearman相关性分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果：1.DEC1mRNA在人正常肝上皮细胞株HL-7702中和人肝癌细胞株：SMMC-7721, HepG-2, Bel-7402和Hep-3B细胞中均有表达。结果通过分析软件对条带灰度进行半定量分析,以内参基因(β-actin)调整mRNA量的差异。结果显示正常人肝上皮细胞中DEC1的表达量高于人肝癌细胞株,但差别没有统计学意义。提示DEC1在转录水平的差异并不明显。2.流式细胞检测结果显示DEC1在肝癌细胞株Bel-7402中的标记率为56%,提示DEC1蛋白在肝癌细胞株Bel-7402中有高表达。3.免疫细胞化学染色结果可以对DEC1蛋白表达进行亚细胞定位,在人正常肝上皮细胞株HL-7702,肝癌细胞株HepG-2、Bel-7402中,DEC1蛋白在细胞核及细胞浆中表达阳性,但以HL-7702细胞核DEC1蛋白表达较强。4.生物素标记和非生物素标记抗体在肝组织免疫组化中的应用差别：对同一来源的肝组织标本,应用生物素标记的二抗检测肝组织细胞中的目的抗原时,胞浆内有弥散分布的棕黄色颗粒；而应用非生物素标记的二抗,胞浆的显色则为阴性。5.正常肝组织标本中DEC1的表达特点：在正常肝组织中,DEC1的表达模式为：弥散性的肝细胞胞浆阳性表达,伴随着不同程度的胞核阳性表达。中央静脉周围的肝细胞胞浆中可见DEC1蛋白的颗粒性表达,而在汇管区周围的肝细胞胞浆中没有这种表达方式。DEC1蛋白不同的肝细胞胞浆表达模式可能与肝小叶特殊的解剖结构及独特的血液供应模式有关。中央静脉周围通常低氧、低养分、并具有较高的酸度,这些特点可能导致了肝细胞的颗粒型表达模式；DEC1蛋白的弥散型表达模式可能是非缺氧依赖性的。血管内皮细胞和胆管上皮细胞呈现不同程度的DEC1表达阳性。6.肝癌及癌旁组织中DEC1的表达特点：在几乎所有肝组织标本中的肝细胞中,DEC1在细胞浆中均有弥散性表达。肝癌组织中DEC1核表达的阳性率为57.1%(36/63)；而在相对应的癌旁组织中DECl核表达的阳性率为27.0%(17/63)。与肝癌组织相比,癌旁组织中DEC1的核表达降低(P=0.001)。正常对照中的DEC1的核表达率略高于肝癌组织,差别没有统计学意义(P=0.650)。与正常对照肝组织中的DEC1核表达率相比,癌旁表达低(P=0.002),这可能与肿瘤的机械性挤压和肝细胞对于肝癌细胞的反应性有关。7. DEC1的核表达与临床参数之间的关系：肝癌组织中有36例标本DEC1核表达阳性,其中占高分化、中分化和低分化肝癌的百分比分别为：94.4%(17/18),42.4%(14/33)和41.7%(5/12)。DEC1的核表达率与肝癌组织分化程度有关。在高分化肝癌中DEC1的核表达率高于中、低分化的肝癌,差别有统计学意义(P<0.001)。DEC1的核表达与性别、年龄、肿瘤大小、乙型肝炎病毒感染和肝硬化等临床参数无关。具体数据可能与样本量偏小有关,尚需大样本资料证实。8. DEC1核表达与肝癌分化程度的关系：作为转录因子,DEC1通常在细胞核内发挥作用。我们发现,在分化程度好的肝细胞性肝癌中,DEC1的核阳性表达率及核阳性表达强度均较高。在分化较差的肝细胞性肝癌中,DEC1的核表达较弱,甚至不表达DEC1蛋白。我们比较了DEC1的核免疫反应性与肝细胞性肝癌分化状态的关系。在高分化、中度分化和低分化肝癌中,DEC1核高表达的比率分别为83.3%,27.3%和16.7%。DEC1蛋白的核表达强度与肝细胞性肝癌的组织分化程度呈正相关(r=0.376,P=0.024)。结论：1.人肝组织标本肝细胞胞浆的内源性生物素影响着免疫组化结果的判断,因此对于此类标本,应首先选择非生物素标记的二抗。2.在肝癌细胞株中和正常肝上皮细胞株中,DEC1mRNA均有表达,DEC1蛋白在胞浆和胞核中均有表达。DEC1在肝脏的诸多日常功能中可能发挥重要作用。免疫组织化学方法证实DEC1在肝细胞内有两种表达模式,弥散型和颗粒型。弥散型的表达模式可能是非缺氧依赖型的。颗粒型的表达模式与中央静脉周围的特殊环境因素有关。3.证实在肝细胞性肝癌组织中,DEC1的核表达与肝癌的分化程度相关,DEC1的表达量与分化程度成正比。DEC1可以作为肝细胞性肝癌分化程度的标志物之一。为进一步探索DEC1基因功能及其在肝脏肿瘤中的生物学作用奠定了基础。DEC1的表达、调节和作用有组织特异性。在肝脏中,DEC1参与调节物质、能量代谢和时钟控制等多种生理功能,并且与肿瘤的生成有关,因此DEC1可能位于这个复杂转录调节网络的中心位置。机体组织、细胞中DEC1表达的紊乱打破了整体的稳态,从而导致细胞不正常的增殖、分化和死亡和癌症的发生。4. DEC1参与正常肝细胞的生物周期节律调节、新陈代谢的维护和再生性控制等各方面的调控。在正常肝细胞中发挥重要的稳态作用,其中主要是通过核内表达的DEC1蛋白发挥转录调控作用。而在肝癌组织中随分化程度由高到低,DEC1核表达逐渐降低,其作为转录因子发挥的调控作用减弱,造成细胞内稳态失衡,肿瘤进一步恶化。