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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、纤维细胞等在某些抗原刺激和细胞因子诱导下产生的。GM-CSF能够作用于树突状细胞,增强其数量及抗原递呈能力,这可能在肌肉内DNA接种所诱导的免疫应答中起到了极其重要的作用;可增强IL-2的产生,活化CD4~+T细胞,使其分泌抗体的能力增强。同时也能够增强CD8~+T细胞的生物活性。可以用来作为DNA疫苗的免疫佐剂,增强DNA疫苗的免疫原性。山羊传染性胸膜肺炎也称山羊支原体肺炎,是对我国养羊业危害较大的疾病之一。其临床表现为高热、咳嗽、渐进性消瘦等,久病不愈的病羊常常丧失生产性能。它所造成的直接损失是由于它的高死亡率,产量的下降,以及疾病治疗成本高。因此被认为是世界上危害性最大的山羊疾病。引起山羊传染性胸膜肺炎的病原体为丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri)。丝状支原体山羊亚种为细小、高度多形性的微生物。丝状支原体山羊亚种的脂蛋白LppA是丝状支原体山羊亚种重要的抗原组成成份。其蛋白分子的二级结构、亲水性区域及抗原指数等研究报道较少。本研究首先从山羊的脾淋巴细胞中提取总RNA,再采用RT-PCR的方法扩增出山羊的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),并进行克隆。用生物信息学软件对山羊GM-CSF序列进行分析并做了同源性比较。本研究克隆的山羊pGM-CSF基因完整的阅读框架长度为435bp,编码144个氨基酸。与其它物种的GM-CSF基因序列比较,除鸡外,其它的同源性都较高,山羊GM-CSF基因核苷酸序列与绵羊、牛、猪、马、狒狒、猕猴、人、犬、猫、小鼠和鸡的核苷酸序列同源性分别为97.7%、91.5%、86.5%、88.3%、83.7%、84.9%、85.3%、83.0%、84.9%、73.1%、39.1%。山羊GM-CSF基因核苷酸序列与绵羊关系最近,其次为牛、猪、马。实验结果表明:山羊的GM-CSF基因被成功克隆。为构建山羊支原体lppA和GM-CSF融合质粒奠定了基础。其次,根据丝状支原体山羊亚种PG3株lppA基因序列设计引物扩增lppA基因,并进行克隆。用生物信息学软件对lppA基因序列进行分析并进行了蛋白分子的二级结构、亲水性区域及抗原指数等的测定。结果表明:扩增出了1256bp左右的lppA基因片段,与预期的结果一致。克隆的lppA基因核苷酸序列包含一个开放阅读框(ORF),编码着脂蛋白质LppA的前体—523个氨基酸残基。克隆山羊支原体lppA基因核苷酸序列测定及氨基酸序列比对结果发现:在lppA的第67、136和676处的碱基分别发生变化,lppA氨基酸在第20位和第223位存在差异,另一处为同义突变。脂蛋白LppA存在约15个α螺旋区,19个β折叠区和较多的拐点区。除了N-端5-25位氨基酸存在稍大的疏水区域,LppA的绝大部份为亲水区。与其相似的是该蛋白的抗原性,除了N-端5-25位氨基酸外,LppA绝大部份区域的抗原性均较强。lppA基因稀有密码子的分析结果表明:lppA基因中含有两个密码子UGA,编码Trp,但在大肠杆菌中UGA为终止密码子。这将导致该基因无法在大肠杆菌中顺利表达。因此,在后续的实验中应考虑用突变的方法将该基因中TGA突变为TGG,以便能在大肠杆菌中表达。综上所述,本研究成功克隆了山羊的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因和丝状支原体山羊亚种PG3株表面抗原LppA的基因。用生物信息学软件对两种基因序列进行分析,并进行了蛋白分子的二级结构、亲水性区域及抗原指数等的测定。为山羊支原体胸膜肺炎的DNA疫苗的进一步研究做了铺垫。