研究背景胰腺癌是临床上具有高度恶性、病情进展快、预后极差的消化道肿瘤,其中胰腺导管腺癌(PDAC)发病率占胰腺癌的80%。近几年来,胰腺癌的发病率呈现上升的趋势,而胰腺癌的早期临床症状不明显,并且目前临床上还没有既经济又有效的发现胰腺癌的方法,患者就诊时已经多处于疾病晚期,所以胰腺癌的主要治疗策略应该着眼于术中肿瘤完全切除或者术后彻底的辅助治疗。分子影像学是新兴起的将生物学与影像学相融合发展的一门交叉学科,分子影像学的技术能够在细胞、分子水平上观察生物体组织的分布、代谢以及功能作用,从而帮助临床医生精确定位病灶,以及后续的相关治疗。分子影像技术与目前临床上现有的传统影像手段相比较,其主要不同在于使用了不同的探针。目前应用广泛的影像学技术如X射线、CT和MRI,通常是利用造影剂导致目标部位与正常组织密度或者水的含量不同而造成差别,实现目标部位的显像。分子影像技术是使用一种探针,如分子或纳米靶向探针,能够和特定的靶点稳定结合,从而利用光学或光声技术使得目标部位成像。由于分子或者纳米探针可以细化到细胞水平的成像,感知细微的变化,所以与传统的手段相比,分子成像精度高,分辨率高,信倍比较好,在区分病灶和正常组织方面有更明显的优势。近红外荧光成像作为一种安全、无放射性的成像模式,可以利用近红外成像系统对肿瘤部位进行成像,甚至实现微小肿瘤的检测。并且同其他成像方式相比,近红外成像迅速快捷。因此,许多研究以近红外成像的纳米探针为基础,利用靶点-靶标的结合,将探针携带到肿瘤组织,达到肿瘤的诊断和治疗一体化的目标。肿瘤组织的光热治疗是能够利用纳米探针将光能转化为局部热能,产生高温杀灭肿瘤细胞的方法。光热治疗具有创伤小、副作用小、能够局部应用的特点,与传统的术后辅助疗法相比具有明显的优势。单壁碳纳米管是碳材料中比较稳定和应用广泛的光热材料之一。它能够最大限度的吸收近红外光,然后将光能转化成热能,产生局部高温,杀死肿瘤细胞。然而单壁碳纳米管在功能化之前毒性比较大,并且不溶于水,也不融于有机溶剂,因此现阶段的研究在将单壁碳纳米管应用于生物领域之前,先将其进行表面修饰,减少毒性的同时,也增加了生物相容性,有利于更好的进入肿瘤目标区域。在生物近红外光成像方面,单壁碳纳米管可以通过肿瘤的滞留效应(EPR效应)在肿瘤组织中富集,并且在一定波段内激发后成像,在808nm的近红外波长照射下进行光热转换,达到光热治疗的目的。Cy5.5是一种花菁类的荧光染料,能够溶于水,目前被广泛用于检测和标记蛋白或者某些生物分子。当Cy5.5被近红外波长为678-680 nm激发以后,能够释放出大约为695-700mn波长的近红外光,并且被近红外成像系统检测到,从而可以看到肿瘤所在,有利于最大程度的清除病灶。在前期的研究基础上,我们利用近红外荧光分子成像技术,使用Cy5.5荧光染料与单壁碳纳米管结合,对肿瘤进行诊断,勾勒出肿瘤的位置及其轮廓。利用单壁碳纳米管的光热转换性能,利用808nm激光照射,产生局部高温,杀灭肿瘤细胞,消除术后残余灶的同时,也最大程度饿减少正常组织的损伤,达到治疗效果。同时我们在研究过程中不断调节纳米探针的浓度、激光照射时间以及激光照射功率,比较诊断和光热治疗效果,以期望达到最优的治疗方式方法。术后密切观察动物体重、肿瘤大小以及生存时间的变化,从而评估纳米探针毒性大小和光热治疗效果。研究目的1、优化单壁碳纳米管的生物特性,使之生物分散性、相容性达到最优;2、单壁碳纳米管偶联近红外染料后体内分布和代谢特点;3、综合分析单壁碳纳米管偶联近红外染料对光热治疗效果的评估。研究方法1、实验材料:PEG-WM3500,硝酸,浓硫酸,去离子水,单壁碳纳米管,Cy5.5,95%乙醇。2、生物材料:PDAC细胞系Panc-1,乳腺癌细胞系MCF-7,细胞培养液,Balb/c裸鼠,75%酒精。3、实验设备:紫外可见光吸收光谱仪,IVIS小动物活体成像系统,体式荧光显微镜,倒置荧光显微镜,热重分析仪,小动物全血分析仪,透射电子显微镜,酶标仪,热成像仪,808激光器,小动物麻醉装置。4、细胞培养和种植:MCF-7乳腺癌细胞、Panc-1PDAC细胞(ATCC)在标准条件下培养。Balb/c老鼠从北京维通利华动物中心购买,并按照动物中心饲养要求饲养。裸鼠皮下瘤模型的建立取40只5-6周雌性BALB/C裸鼠,分别抽取含2×106 Panc-1胰腺导管腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞悬液接种于裸鼠腋部皮下,各20只,建立裸鼠皮下PDAC、乳腺癌移植瘤模型。5、探针的生物分布:单壁碳纳米管在老鼠体内的组织分布是通过IVIS检测Cy5.5的荧光强度来确定的。将纳米探针分别尾静脉注射到10组老鼠体内,通过IVIS的实时检测,观察肿瘤富集SWNT-Cy5.5最多的时间点,记录,并选择此时间点进行光热治疗。治疗后观察裸鼠的体重、肿瘤大小、生存时间,以对光热治疗进行评估。6、光热治疗:通过探针的生物分布,选择最佳时间点,利用808nm激光器照射肿瘤,使之产生局部高温,杀灭肿瘤细胞。裸鼠皮下的肿瘤大小每隔一天用游标卡尺量其长宽,用肿瘤体积=a×b×b/2的方法来计算,其中a为肿瘤的最长径,b为肿瘤的最短径。研究结果静脉注射了单壁碳纳米管耦联Cy5.5的探针且经过光热治疗的裸鼠,肿瘤消失,并在光热后两天结痂,光热后15天左右结痂脱落,没有复发。注射单壁碳纳米管耦联Cy5.5且没有进行光热治疗的裸鼠肿瘤日渐变大,与注射PBS缓冲液且没有治疗的对照组相比,肿瘤长大的速度较缓慢,但没有起到治疗作用。结果证明,无论是单独的近红外光治疗,还是单纯注射单壁碳纳米管,都不会影响肿瘤的生长,均达不到良好的治疗效果。研究结论在用光热治疗的方法杀灭肿瘤细胞时,我们只是使用较低的激光功率就能达到良好的治疗效果,并且在治疗的同时还能够减少对正常组织的伤害,因此,我们猜想,如果实验中能够适当地增加激光功率,适当调节照射距离等,在保护正常组织的情况下,或.许能够达到更好的疗效。本课题主要是研究单壁碳纳米管光热杀灭肿瘤细胞的实验。我们猜想,首先若在光热治疗时,使得单壁碳纳米管载化疗药,一同进入肿瘤组织,将局部化疗和光热治疗相结合,可以得到更好的疗效。其次,在单壁碳纳米管的体内代谢方面,进一步研究其表面修饰,争取使其发挥最好光热治疗效果的通知,减少对其他正常组织的毒性。最后,本课题的关键在于纳米探针在肿瘤组织内的蓄积量,这是达到良好光热治疗效果的重点。