乳腺癌（Breast cancer）,是妇女常见的恶性肿瘤,在全部恶性肿瘤中发病率仅次于肺癌。这些年来,乳腺癌的发病率已经呈明显上升趋势,已成为成年女性（18-59岁）死亡的最主要原因,严重威胁全世界女性的身心健康甚至于生命。早期乳腺癌手术后易复发治疗效果不佳,乳腺癌晚期并发转移的患者治疗效果更差,且生存时间短,死亡率高。这在临床工作中要求我们要更加深入的研究乳腺癌发生、发展的分子学机制,探求针对乳腺癌治疗更为安全有效的化疗药物,延长病人的中位生存时间,改善生存质量。自从1994年在白血病中分离肿瘤干细胞以来,一部分学者认为肿瘤组织用有一部分具有自我更新和分化潜能的细胞在肿瘤的发病中扮演着重要角色,这类细胞驱使肿瘤细胞失去调控,增强放化疗的抵抗性。肿瘤干细胞假说为我们对恶性肿瘤的临床治疗提供了一个全新的研究方向。肿瘤中一部分具有自我更新能力而且能产生异质性肿瘤细胞的细胞,具有无限增殖和分化潜能的细胞,我们称为肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）。在乳腺癌中也存在此类细胞,我们称之为乳腺癌干细胞（Breast Cancer stem cells,BCSCs）。进一步研究BCSCs的生物学特性,了解并发现BCSCs的鉴别方法对乳腺癌的临床治疗有重要的意义。CD44⁺CD24^-/low是目前分选BCSCs最常用的标记物。进来实验室主要靠添加bFGF和EGF这两种生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行悬浮成球培养,建立体外研究乳腺癌干细胞的生物学模型。悬浮成球培养技术为乳腺癌干细胞的进一步研究提供了可行的技术支持。三氧化二砷（As₂O₃）是砒霜的主要成份,在我国针对三氧化二砷对白血病的研究已经取得了国际上领先的成果。最近研究成果表明三氧化二砷在对急性早幼粒白血病中起着重要作用,主要通过对急性早幼粒白血病蛋白（PML-RAR）的调节,使其降解,从而消除白血病细胞,达到根治。而在乳腺癌干细胞中PML-RAR也呈高表达,我们探索和研究三氧化二砷作用于乳腺癌干细胞后的作用以及相关机制,有可能为乳腺癌的临床诊疗提供一种潜在的理论依据。第一部分三氧化二砷处理后的乳腺癌干细胞的生物学特性及PML基因的机制材料方法1.细胞贴壁培养及悬浮培养把MCF-7细胞贴壁培养,采用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基,在条件为5%CO2、37℃的细胞培养箱中进行常规培养,每1²天换液,隔3⁴天传代。然后把已经贴壁的MCF-7乳腺癌细胞重悬于含5ug/mL胰岛素B27、20ng/mLhEGF、和0.4%牛白蛋白的DMEM/F12培养基中,在条件为5%CO2、37℃的细胞培养箱中进行悬浮培养,每3-4天半量换液培养,每7-10天传代培养。2.球囊中CD44+CD24-/low癌细胞比例的测定收集用无血清培养的微球囊癌细胞,用胰酶消化后机械吹打,制成为单细胞悬液,再用PBS液重新悬细胞,每管浓度约为1×10⁶/100uL。分别设置同型对照组和实验组。在实验组加入CD44-FITC和CD24-PE的单克隆抗体,对照组同时加入相应的同型对照抗体,在室温避光孵育30min,并且用PBS洗涤两次后再用500ulPBS重悬,1小时之内上流式细胞仪检测,测定MCF-7乳腺癌细胞微球囊中CD44+CD24-/low细胞的比例,重复检测三次。3.球囊癌细胞存活率测定无血清培养的微球囊癌细胞被收集后,用胰酶消化后再机械吹打为单细胞悬液,悬液以5×10⁵/mL浓度接种于96孔板之中,每孔接种5uL,设置实验组（三氧化二砷）和对照组（未加任何试剂）,每组6个复孔,在37℃,5%浓度CO2的细胞培养箱中分别悬浮培养24h、48和72h后,应用WST-1还原法检测浓度不同各组对MCF-7乳腺癌细胞微球囊细胞的增殖抑制作用,并绘制生长抑制曲线,此实验重复三次。4.细胞周期检测无血清培养的微球囊癌细胞被收集后,胰酶消化后再机械吹打为单细胞悬液,悬液以5×10⁶/mL的浓度接种于96孔板,且每孔接种10uL。设三氧化二砷8.0umol/L组、2.0umol/L组和对照组,于37℃、5%CO2的细胞培养箱中再悬浮培养48h,然后收集各组细胞,用胰酶消化后再机械吹打制成单细胞悬液,离心机上低速离心后去上清液,然后加入1mL冰浴预冷70%乙醇,在4℃条件下固定12h,用0.5mL碘化丙啶染色液染色,于24h内完成流式检测。5.RT-PCR（反转录PCR）分析乳腺癌MCF-7细胞组、乳腺癌MCF-7球囊细胞组、三氧化二砷2umol浓度的As2O3处理乳腺癌MCF-7悬浮球囊细胞48h后组的PMLmRNA的转录情况;6.Western bolt分析乳腺癌MCF-7细胞组、乳腺癌MCF-7球囊细胞组、2umol浓度的As2O3处理后乳腺癌MCF-7悬浮球囊细胞48h后组的PML蛋白的表达情况。7.统计分析试验中全部数据均采用SPSS17.0统计软件进行处理。计量资料均采用均数±标准差（x±s）方法表示。多组计量资料之间的比较均采用单因素方差分析法,组间两两的比较均采用LSD检验比较。检验水准P<0.05有统计学意义。结果1.MCF-7细胞贴壁培养及悬浮培养细胞形态2.CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞比例悬浮球囊培养和贴壁培养的乳腺癌MCF-7细胞中CD44+CD24-/low干细胞比例分别为（1.73±0.25）%、（62.39±2.77）%,统计分析表明两者差异有统计学意义（F=7.5878,P=0.001）。3.球囊细胞存活率测定在三氧化二砷浓度为0.5².0umol/L的较低范围内,球囊细胞的总存活时间趋势呈升高态势（F=31.788,P=0.000<0.05）,这就表明低浓度As2O3有可能诱导乳腺癌干细胞的分化并促使其增值,当药物浓度为2.0umol/L时,处理48h小时球囊细胞存活率最高;当三氧化二砷浓度为2.0⁸.0umol/L的较高范围内,球囊细胞的总存活时间趋势呈降低态势（F=18.771,P=0.000<0.05）,这表明高浓度As₂O₃极有可能抑制了乳腺癌干细胞的增值。4.细胞周期检测设置实验组和对照组,在未经As₂O₃处理过的MCF-7乳腺癌球囊细胞（对照组）组中G0/G1、G2、S期细胞比例分别为91.80±1.06、4.77±0.37和4.13±1.08;而经过浓度为As₂O₃（2.0umol/L）处理的MCF-7球囊细胞（实验组）组中G0/G1、G2、S期细胞比例分别为55.55±1.34、10.79±0.27和31.36±1.12;而经过浓度为8.0umol/LAs2O3处理过的MCF-7乳腺癌球囊细胞（实验组）中G0/G1、G2、S期细胞的比例分别为23.41±0.62、56.44±0.95和19.14±0.41,而凋亡率为（6.23±0.62）%。经统计学分析表明,未加药组各期细胞比例与不同药物浓度组中各期细胞比例相比较分布不同,差异有统计学意义（P<0.05）。5.RT-PCR（反转录PCR）乳腺癌MCF-7细胞PMLmRNA的转录水平低于乳腺癌MCF-7球囊细胞;而乳腺癌MCF-7悬浮球囊细胞用2umol浓度的As₂O₃处理48h后,其PMLmRNA转录水平与乳腺癌MCF-7球囊细胞无明显差异。6.Western blot未经As₂O₃处理MCF-7悬浮球囊细胞和经2umol浓度As₂O₃作用48 h后的MCF-7悬浮球囊细胞,PML蛋白表达明显降低（P=0.000）。乳腺癌MCF-7细胞较未应用As₂O₃处理MCF-7悬浮球囊细胞组PML基因蛋白表达降低（P=0.000<0.05）。第二部分载体的构建以及裸鼠成瘤材料与方法1.针对已知PML蛋白基因的cDNA序列,设计并合成4条特异性干扰序列（PML-shRNA-1、PMLshRNA-2、PML-shRNA-3、PML-shRNA-4）和1条非特异性序列（PML-shNC）。2.利用脂质体介导的转染技术将shRNA转染至乳腺癌MCF-7细胞,通过半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白印迹技术（Western blot）检测SNCG基因被干扰后在mRNA及蛋白水平的表达变化。3.分别用经转然后的MCF-7悬浮球囊细胞、三氧化二砷处理过的MCF-7悬浮球囊细胞以及MCF-7悬浮球囊细胞在裸鼠皮下种植移植瘤。结果1.脂质体介导的转染技术可将PML-shRNA成功转染至乳腺癌MCF-7细胞。2.RT-PCR和Western blot结果显示PML-shRNA转染至乳腺癌MCF-7细胞后,PML蛋白基因在mRNA及蛋白水平的表达均明显降低（P<0.05）。3.MCF-7悬浮球囊细胞在10³/mL浓度可以皮下成瘤,而经三氧化二砷处理过的MCF-7悬浮球囊细胞以及将PML-shRNA转染至乳腺癌MCF-7细胞均未成瘤。结论1.用含细胞因子的无血清培养基在低粘附条件下能有效富集乳腺癌干细胞;2.低浓度As₂O₃可以诱导MCF-7球囊细胞分化进入分裂增殖期并促其增殖;高浓度As₂O₃可以抑制已分化MCF-7球囊细胞的增殖并诱导其凋亡。3.三氧化二砷对乳腺癌干细胞具有抑制作用,可能通过下调PML蛋白途径实现。4.将PML-shRNA转染至乳腺癌MCF-7悬浮培养球囊细胞后,可明显下调PML蛋白基因在mRNA及蛋白水平的表达。5.乳腺癌干细胞在10³/mL浓度级别上可以使裸鼠皮下种植成瘤,而经过三氧化二砷处理的乳腺癌干细胞在同等浓度下不能成瘤,鉴定了乳腺癌干细胞特性。