转LjHsp70-15基因百脉根种质创制及抗逆性分析

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逆境胁迫严重影响牧草生长发育、产量和品质。受高温、低温、干旱和盐碱等多种逆境因子诱导产生的热激蛋白(Hsp),具有修复受损细胞和减少伤害的作用。百脉根(Lotus japonicus)是一种主要分布于温暖湿润地区的多年生优质豆科牧草,营养价值高,适口性好。本论文利用模式植物拟南芥转化和百脉根瞬时表达,探究百脉根热激蛋白基因LjHsp70-15的抗逆调节功能,并进一步利用该基因创制逆境胁迫耐受的百脉根牧草新种质,以为岩石裸露、土层瘠薄、高温干旱的喀斯特岩溶地区的抗逆性牧草培育和应用提供依据。主要研究结果如下:对百脉根基因组(版本号V3.0)分析表明,百脉根LjHsp70家族由18条成员组成,外显子和内含子数量在1~8之间,属于酸性亲水蛋白,含有低温、干旱、细胞周期、防御压力反应、生长素和光反应等响应和调控元件。其中,LjHsp70-15基因的外显子和内含子数目最多,定位于内质网,含有典型的低温和干旱诱导等逆境胁迫响应元件。构建植物表达载体pSH-35S-LjHsp70-15进行LjHsp70-15基因的植物遗传转化。沾花法转化获得8株转基因(TP)拟南芥植株,发现LjHsp70-15表达不影响受体拟南芥的叶、花、莲座分枝数的发育,但对株高有一定促进作用。不同温度和不同浓度梯度Na Cl处理表明,表达LjHsp70-15基因提高了拟南芥种子的萌发生长能力和盐胁迫耐受性。42℃高温和4℃低温胁迫处理表明,在较极端温度中,LjHsp70-15基因表达能较好维持受体拟南芥的细胞膜完整性,并通过增加保护酶活性和减少MDA含量实现其逆境保护作用。优化百脉根瞬时遗传转化参数获得瞬时表达LjHsp70-15基因的TP百脉根。高温和Na Cl胁迫处理发现,LjHsp70-15可能参与逆境中的细胞膜结构稳定性调节。利用农杆菌介导遗传转化方法获得组成型表达LjHsp70-15基因的TP百脉根4株。42℃高温、4℃低温、250 mmol/L甘露醇和150 mmol/L Na Cl胁迫处理表明,TP百脉根具有良好的高温、低温干旱和盐胁迫耐受性,该耐受性与保护酶活性增强和MDA含量降低有关。研究表明,LjHsp70-15基因具有良好的抗逆调节功能,利用该基因可有效改善高温、低温、干旱和高盐等逆境因子对百脉根牧草的影响,研究结果可为抗逆牧草分子育种提供一定依据。
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