异戊二烯是合成橡胶的重要单体，同时也是医药、香料和农药等领域的重要原料。虽然异戊二烯广泛存在于自然界，但是由于收集困难，目前工业应用的异戊二烯主要来自石油化工副产物，价格受石油工业波动影响，因此，开发绿色可持续的异戊二烯合成方法势在必行。生物法合成大宗化学品具有环境友好、条件温和、原料可再生等优势。由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)遗传背景清楚，分子操作系统成熟，已经作为细胞工厂广泛用于多种萜烯类产物的合成，本研究以酿酒酵母为底盘，结合蛋白质工程、代谢工程等手段，探讨异戊二烯异源生物合成的综合调控策略，以提高酿酒酵母合成异戊二烯的能力，为异戊二烯的发酵法生产奠定基础。
　　代谢流的强化和平衡是目标产物高效合成的重要前提。在酿酒酵母的异戊二烯合成途径中，异戊二烯合酶(ISPS)是一个关键的限速酶。虽然在前期工作中已经通过定向进化的方法初步改善了异戊二烯合酶的催化性能，但是仍然不足以快速转化积累的前体物。为了促进异戊二烯的合成，需要进一步提高ISPS的催化效率。因此，对定向进化筛选获得的两个突变热点(340位和570位)进行了饱和突变和组合突变，筛选出最优突变体ISPSLN，其催化效率比野生型提高了近3倍。增强下游途径后，IPP（异戊烯焦磷酸，isopentenyl pyrophosphate）和DMAPP（二甲基丙烯基焦磷酸，dimethylallyl diphosphate）的充足供应成为限制异戊二烯合成的关键节点。因此，分别通过在线粒体中构建异戊二烯合成途径以及细胞质推-拉-阻调控来增强异戊二烯合成前体的供应，并利用焦磷酸物质过度积累造成细胞毒性的特性，在细胞质改造菌株和线粒体改造菌株中基于生物量和副产物积累情况的变化来调控关键节点基因MVD1(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，diphosphomevalonate decarboxylase)和IDI1(异戊二烯基二磷酸6-异构酶，isopentenyl-diphosphate delta-isomerase)的表达量，从而重建异戊二烯合成途径上下游之间的代谢平衡。最终通过单倍体杂交构建线粒体-细胞质双重调控菌株，在补料发酵中，异戊二烯的产量达到11.9g/L。
　　为了方便后续实验操作，构建了以tRNA加工为切割原理的CRISPR/Cas9质粒工具，在酿酒酵母基因组位点GPD1、GPD2和MPC3上进行单位点、双位点以及多位点操作验证，结果表明，该套系统可以高效地对单个或者多个靶点进行切割，并且可以100％地进行同源重组，从而达到基因敲除的目的。利用这套基因编辑系统，对线粒体-细胞质双调控菌株进行了进一步的代谢改造。线粒体和细胞质异戊二烯生物合成途径中的共同前体物质为细胞质中的丙酮酸，因此丙酮酸向线粒体的转运情况影响着这两个细胞区室中异戊二烯合成途径的碳源分配。过表达丙酮酸转运蛋白后异戊二烯产量下降，而下调丙酮酸转运则将异戊二烯产量提高了20％，说明与细胞质途径相比，线粒体的合成途径相对较弱。但是在细胞质改造的双倍体对照菌株中，下调和敲除丙酮酸转运蛋白基因MPC3后，异戊二烯的产量仍然低于线粒体-细胞质双调控菌株。这可能是因为酿酒酵母中存在两种丙酮酸转运体系MPC1/MPC2和MPC1/MPC3，即使敲除MPC3也无法将丙酮酸全部截留在细胞质中用于异戊二烯合成，所以在碳源利用率方面线粒体-细胞质双调控菌株更有优势。最终，完全敲除丙酮酸线粒体转运蛋白MPC3的线粒体-细胞质双调控菌株YXMH32-KOM-ISPSLN在补料发酵中异戊二烯产量可达14.3g/L，这是目前报道的真核生物中最高的产量。
　　考虑到乙醇是酿酒酵母工程菌株中主要的代谢副产物，如能合理控制其合成将有利于目标产物碳利用率的进一步提升，因此尝试在酿酒酵母中构建乙醇响应系统。首先对构巢曲霉(Aspergilus nidulans)来源的乙醇响应蛋白AlcR及其控制的启动子PALCA在酿酒酵母中进行了异源表达，但是发现PALCA在酿酒酵母中没有乙醇响应性，而为组成型表达。因此，通过不同长度的两端截短和定向进化的方式对该启动子进行了改造，以期实现严格的乙醇调控。但是，没有获得具有乙醇诱导响应的突变体。虽然没有取得理想的结果，但是本部分工作证明了调控蛋白AlcR在酿酒酵母中对启动子PALCA具有增强作用，为后续在酿酒酵母中构建控制细胞生长和产物合成的乙醇响应系统提供了有益的借鉴。
　　本研究利用合成生物学的手段提高了酿酒酵母合成异戊二烯的能力，探讨了代谢综合调控策略，为生物法合成异戊二烯的工业化提供了基础并为其他萜烯类产物的生物合成提供了参考。