论文部分内容阅读
吡咯喹啉醌（PQQ）是参与氧化还原反应的辅因子，作为许多酶的辅酶，如脱氢酶，氧化酶，水合酶与脱羧酶。PQQ含有能直接参与氧化还原反应的邻醌类结构，以上酶蛋白可以催化非磷酸化的底物发生氧化反应，如醇类，醛类和醛糖类。此外，PQQ还被认为是继吡啶和核黄素之后的第三类参与氧化还原反应的辅因子。现已知与PQQ合成相关的基因有7个，在生物体内通常成基因簇。功能相近的基因具有一定同源性，并按一定顺序排列为pqq基因簇。肺炎克雷伯氏菌中， PQQ基因簇为一段pqqABCDEF的连续基因，约7Kb。本实验以肺炎克雷伯氏杆菌（K. pneumoniae DSM2026）编码PQQ基因簇作为模板，本实验克隆了肺炎克雷伯氏菌中5.5kb的PQQ合成基因簇pqqABCDEF，利用不同启动子，分别以大肠杆菌与肺炎克雷伯氏菌为宿主生物合成PQQ。采用NBT（氧化型）-甘氨酸钾溶液非酶系统测定PQQ含量。并利用无细胞体系原理用细胞破碎液合成PQQ。实验结果表明启动子影响PQQ合成，通过培养基的优化产量达到约1700nM。同时无细胞体系结果为PQQ体外合成提供依据。同时提取大肠杆菌BL21基因组，设计引物得到葡萄糖脱氢酶序列，构建重组BL21大肠杆菌工程菌。IPTG诱导表达，并经过葡萄糖与Mg离子优化培养基，SDS-PAGE检测结果显示PQQGDH得到高效表达。