论文部分内容阅读
目的：为了研究力学信号对骨质疏松症的影响,本实验选用低强度脉冲超声(LIPUS)和体外冲击波(ESW)干预MC3T3-E1细胞,分别对细胞施加不同参数(频率、强度)的超声和冲击波,采取CCK-8法检测细胞的增殖(Proliferation)情况,碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测分化(Differentiation)效果,茜素红染色观察矿化(Mineralization)效果,从而对刺激的不同参数进行筛选。选用小鼠摘除卵巢所致的骨质疏松模型为实验对象,对LIPUS和ESW对骨质疏松症的有效性进行体内验证。骨密度和生物力学检测显示LIPUS和ESW对小鼠骨质疏松症的防治的有效性,五脏病理切片提示了二者的生物安全性。力学信号可能成为对抗骨质疏松症的一种潜在防治方式。方法：1. LIPUS细胞实验小鼠成骨细胞株MC3T3-E1培养于α-MEM培养基,置培养箱内5%CO2、37℃常规培养,3d换液1次,3-4d传代1次。取对数期细胞以2×103个/孔和2×104个/孔的密度分别接种于96孔板和12孔板。实验共分4组：超声组按强度分为30、40、50mW/cm23组及空白对照组(CON),96孔板中每个超声强度设置6个平行孔,12孔板设置4个平行孔。在2/4/6d末分别检测增殖效果,10d末检测碱性ALP活性,14d末检测矿化效果。2.ESW细胞实验细胞培养方式同LIPUS细胞实验部分,实验分组及参数见表1。每组刺激20min/d,于2/4/6d末检测增殖效果,10d末检测ALP活性,14d末检测矿化效果。3. LIPUS和ESW动物实验对健康雌性8周龄SPF级BalB/C小鼠实施双侧卵巢切除术(OVX)建立小鼠骨质疏松症模型。实验设置4组,分别为空白对照组(CON)、雌激素对照组(ESG),超声组(LIPUS)、冲击波组(ESW)每组6只。其中LIPUS组选用的刺激参数为细胞实验筛选出的最佳参数,即1.5MHz-40mW/cm2,5min/次,ESW组选用的刺激参数为细胞实验筛选出的最佳参数,即10.1Hz-1.12g, ESG组采用结合雌激素片溶液灌胃,剂量为0.39mg/kg体重。各组均刺激5d/周,持续8周。干预周期结束后,采用双能X-线吸收法测量脊柱区骨密度(BMD),之后取各组脊柱骨分别进行骨组织生物力学检测,得到最大载荷(Fmax,N)和最大位移(dmax,mm)。取LIPUS组和ESW组小鼠各主要脏器做组织学切片HE染色,镜下观察作安全性评价。结果：1.LIPUS细胞实验1.1增殖：在3个不同频率下,30mW/cm2和40mW/cm2的脉冲超声分别对细胞产生了不同程度的促进作用(P<0.01),而50mW/cm2的脉冲超声均产生了抑制作用(P<0.01)。1.2分化：与对照组比较,1.1MHz-50mW/cm2组、1.5MHz-30mW/cm2组1.1MHz-40mW/cm2组、1.7MHz-30mW/cm2组的MC3T3-E1细胞在脉冲超声作用10天末,其ALP活性均有增加(P<0.05)。1.3矿化：与对照组比较,MC3T3-E1细胞在脉冲超声作用14d后,1.5MHz和1.7MHz的30mW/cm2和40mW/cm2的4个LIPUS组可见明显的矿化结节。2.ESW细胞实验2.1增殖：只有7.3Hz-0.58g组和10.1Hz-0.56g组在6d的OD值增幅具有统计学意义,其余各组细胞增殖幅度不明显2.2分化：较对照组而言,各ESW组均有不同程度的提高,3.3Hz-0.12g组、7.3Hz三组和10.1Hz三组较对照组的增幅均具有统计学意义(P<0.05),其中3.3Hz-0.18g组和10.1Hz-1.68g组的ALP活性有明显提高(P<0.01),其余各组较对照组未见差异。2.3矿化：与对照组比较,3.3Hz-0.12g组、7.3Hz-0.58g组、7.3Hz-0.87g组、10.1Hz-1.12g组和10.1Hz-1.68g组的5个ESW组可见明显的矿化结节,其中10.1Hz-1.12g组的矿化效果更好。3. LIPUS和ESW动物实验3.1建模评价3.1.1雌二醇：手术后小鼠血清中E2含量为28.38pg/mL,显著低于手术前64.72pg/mL (P<0.05)。3.1.2骨密度：手术后小鼠脊柱区高骨密度区域面积(绿色部分)较手术前明显减少,而低骨密度区域面积(红色部分)相应增加。使用仪器自带软件定量分析结果显示,手术后骨密度和骨量较手术前都有明显降低。3.2治疗效果评估3.2.1骨密度：ESG组和LIPUS组高骨密度区域面积有一定增加,ESW组效果不明显。骨密度数据结果显示,LIPUS组和ESW组的骨密度值均较对照组有所提高(P<0.05),在骨量上只有ESW组有提高(P<0.05),其余各组无明显差异。3.2.2最大载荷和最大位移：ESG组、LIPUS组和ESW组三组的最大载荷和最大位移均较对照组有提高(P<0.05),效果最好为ESW组。3.2.3五脏病理切片：未见组织病理学改变,未见出血点,细胞结构完整。结论：1.LIPUS能够有效促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化水平,ESW能够有效促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化水平,在细胞水平二者具有积极意义。2. LIPUS和ESW能够在骨质疏松小鼠体内,有效提高其骨密度,增加骨强度及骨劲度,减缓或抑制骨量丢失,在动物体内二者具有良好的应用效果。3.本实验中采用的摘除卵巢建模方式,得到了预想效果,是一种建立骨质疏松动物模型的有效建模方式。4.实验中所采用的LIPUS和ESW参数及剂量具有良好的生物安全性,其中1.5MHz-40mW/cm2的LIPUS参数和10.1Hz-1.12g的ESW参数作用效果最优。LIPUS和ESW疗法是骨质疏松治疗物理治疗的有效施加方式,且具有一定的生物安全性。