目的1.研究脉络膜黑色素瘤中不同微循环模式与临床病理参数及预后的关系;阐明其不同微循环模式中MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF的表达及意义。2.探讨姜黄素联合内皮抑素对眼内黑色素移植瘤微循环模式及生长的抑制作用;研究其对MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF表达的影响,从而揭示二者从不同途径抑制肿瘤血管生成的相关分子机制,为临床恶性肿瘤的治疗提供新靶点,为寻求高效低毒的治疗药物提供实验依据。方法1.收集脉络膜黑色素瘤56例,复读HE染色切片,初步观察其微循环模式,利用电镜观察血管生成拟态的超微结构;采用CD34/PAS双重染色进一步确认脉络膜黑色素瘤中内皮依赖性血管(E)、马赛克血管(MV)、血管生成拟态(VM)三种微循环模式。根据有无VM分组。分别计数微血管密度(MVD)、MV及VM,以探讨其与病人临床病理指标之间的关系;使用单因素和多因素生存分析研究VM对预后的影响;免疫组化染色检测并比较MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF蛋白的表达,分析这些分子在VM形成中的作用。2.C57/BL6小鼠72只,右眼视网膜下腔注射1×10~5B16黑色素瘤细胞悬液建立移植瘤模型。接种后第3天开始腹腔注射给药,持续18天;给予姜黄素(100mg/kg/日)和内皮抑素(10mg/kg/日)处理,依据处理方式不同分为4组:对照组、姜黄素组、内皮抑素组、姜黄素联合内皮抑素组。于取材前每组挑选2只进行活性炭示踪,以判断VM的功能;每组选2只,用于电镜观察VM结构;同时完整摘取脑、肺、肝、肾、脾,观察药物毒副作用及有无转移;用游标卡尺测量肿瘤体积,比较肿瘤的大小及生长速度;免疫组化法检测并比较移植瘤组织中MMP-9、MMP-2、EphA2及VEGF表达水平的差异;同时采用Real time RT-PCR技术检测并比较各组MMP-2、MMP-9、EphA2 mRNA表达量的差异。结果1.(1)VM与与性别、眼别、年龄无关(P=0.618,0.560,0.687),而与细胞类型、肿瘤最大直径(LTD)、转移有关,差异均有统计学意义。其中含有类上皮细胞患者瘤组织中的VM阳性率(91.67%)高于无类上皮细胞者(48.30%)(P=0.025);有转移者VM阳性率(81.80%)高于无肝转移病人(37.80%)(P=0.027);肿瘤最大直径＞12mm的患者VM阳性率(58.5%)高于=12mm者(47.8%)(P=0.021)。(2)MVD与性别、眼别、年龄无关(P=0.266,0.430,0.316),而与细胞类型、肿瘤最大直径(LTD)及转移有关。并且有类上皮细胞的瘤组织中MVD(53.48±5.14)高于无类上皮细胞者(38.55±3.32)(P=0.017);肿瘤最大直径＞12mm者MVD(55.80±4.86)高于肿瘤最大直径=12mm的MVD(40.16±3.88)(P=0.014);有转移患者的MVD(64.27±8.16)高于无转移者MVD(41.18±3.08)(P=0.003)。(3)VM组中MVD略微低于对照组MVD,但差异无统计学意义(P=0.082)。(4)单因素生存显示,VM组患者生存时间与对照组相比较短(P=0.0076);肿瘤细胞类型、肿瘤最大直径、转移、MVD对患者预后有影响(P=0.0193,0.0231,0.0328,0.0321);而性别、年龄、眼别对预后无影响(P=0.662,0.278,0.885);多因素生存分析显示,肿瘤细胞类型、肿瘤最大直径及VM是影响CM患者预后的独立危险因素(P=0.005,0.000,0.003)。(5)免疫组化染色结果:MMP-2、MMP-9在VM组中的阳性率分别为96.15%与100.0%高于对照组66.67%与80.00%,差异有统计学意义(P=0.000,0.002)。并且VM组MMP-2、MMP-9表达量增高,分别为(57.16±6.39)、(55.96±7.67)高于对照组表达量(36.18±4.55)(38.75±4.12),差异有统计学意义(P=0.000,0.000);EphA2在VM组中的阳性率92.31%高于对照组阳性率70.00%,表达量也随之增高(39.807±8.79),高于对照组表达量(33.36±4.86),差异具有统计学意义(P=0.002,0.002);VEGF在VM组与对照组的阳性率及表达量之间差异均无统计学意义(P=0.089,0.419)。2.(1)免疫组化双重染色和电镜结果显示:眼内移植瘤微循环模式中三种微循环2.(1)免疫组化双重染色和电镜结果显示:眼内移植瘤微循环模式中三种微循环模式共存。MVD及MV数目在各实验组瘤组织中明显降低(P＜0.05);MV数目仅在姜黄素组及联合组瘤组织中显著减少(P＜0.05)。(2)活性炭示踪结果显示:移植瘤中VM结构中央区大量黑色炭颗粒出现,提示VM与内皮依赖性血管是相互连通的,以不同的方式维持肿瘤组织的血液供应。(3)肿瘤体积测量及器官转移结果:各处理组肿瘤均较对照组生长缓慢(F=8.30,P＜0.05);其中,姜黄素组、联合组与对照组之间肿瘤平均生长体积差异有统计学意义(t=P＜0.05)。各实验组肺转移率5.6%低于对照组16.7%,但差异无统计学意义(P＞0.05)。(4)免疫组化及实时荧光定量PCR结果:①MMP-9、MMP-2、EphA2胞浆阳性着色,棕黄色,肿瘤细胞阳性表达率从高到低依次为对照组、内皮抑素组、姜黄素组、联合组;VEGF阳性表达率内皮抑素组最低,对照组最高。而且MMP-2、MMP-9、EphA2及VEGF在各处理组中的表达与对照组比较,差异均有统计学意义(F=15.48,F=17.35,F=4.56,F=6.08,P＜0.05)。②MMP-2、MMP-9及EphA2mRNA在各处理组表达量也明显低于对照组(F=19.35,F=19.43,F=8.13,P＜0.05),其中MMP-2、MMP-9 mRNA在姜黄素组及联合组与对照组之间平均表达量差异有统计学意义(t=7.17,4.53,P＜0.05);EphA2 mRNA表达量在联合组瘤组织中明显降低(t=2.52,P＜0.05)。结论1.(1)在脉络膜黑色素瘤中,VM、MVD与肿瘤细胞类型、肿瘤最大直径及转移有关。肿瘤体积越大,VM阳性率越高,且患者越易发生转移,有VM患者的生存时间明显短于无VM者;含有类上皮细胞的CM中VM阳性率增高。(2)VM可作为判断脉络膜黑色素瘤患者预后的一项指标,是影响其预后的独立危险因素。(3)VM阳性的脉络膜黑色素瘤中MMP-2、MMP-9及EphA2表达明显增高,而VEGF无显著升高,提示VM的形成机制不同于经典的内皮依赖性血管生成,MMP-2、MMP-9、EphA2是VM形成中的重要分子,VEGF不是影响VM的主要因素。2.(1)眼内移植瘤组织并存有VM、马赛克血管和内皮依赖性血管三种微循环模式,并且VM与宿主血管相连,共同为肿瘤提供营养。(2)姜黄素主要通过下调MMP-2、MMP-9及EphA2的表达,抑制VM的形成及肿瘤血管生成。内皮抑素主要通过下调VEGF的表达,抑制内皮依赖性血管生成,二者联合应用,具有协同增效作用。(3)姜黄素联合内皮抑素将成为一种安全有效的抗肿瘤方法。