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目的:帕金森病(Parkinson‘s disease)业已成为仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统变性疾病。帕金森病的患病率和发病率均呈逐年上升趋势。黑质致密部、蓝斑和中缝核等处的多巴胺能神经元渐进性变性损伤,神经元凋亡为帕金森病的主要病理特征,多巴胺神经元突触投射到相应的纹状体,最终导致纹状体中多巴胺水平下降,导致脑内神经递质稳态的失衡,患者产生相应运动及非运动症状。目前,尚无完全治愈帕金森病的药物或疗法,临床的药物主要以非疾病修饰治疗为主的。帕金森病的确切发病原因尚不十分清楚,其病理机制改变为交互式,多重级联反应最终导致病理改变,在这一过程中,氧化应激,线粒体功能缺陷,α-突触核蛋白等毒性蛋白聚集,内质网应激障碍,钙离子稳态失衡,单胺氧化酶B活性下降,神经炎症,谷氨酸兴奋性神经毒性损伤等机制均可能参与了帕金森病病理生理过程,且其中可能涉及内在遗传背景和外界环境因素。顺式-(-)-ε-维尼非林(Trans-(-)-ε-viniferin,ε-viniferin)是一种具有五元氧环的白藜芦醇的脱氢二聚体。尽管白藜芦醇在临床上没有被证实对特定疾病有治疗作用,但是,这两种化合物可以通过不同的信号通路调节多种神经生物学效应。在抗氧化和抗炎方面,ε-viniferin的生物学活性比其单体白藜芦醇更高效。ε-viniferin被证实可以促进Aβ聚合体解离,并有抑制神经炎症作用。ε-viniferin可通过激活SIRT3/LKB1/AMPK信号通路,促进自噬流,在亨廷顿舞蹈病中起到神经保护作用,上述研究证实ε-viniferin对神经变性疾病具有潜在多靶点治疗价值。SIRT3(sirtuin 3)是一个重要的线粒体去乙酰化修饰酶,具有去乙酰化酶特性,能够调控线粒体中多种酶及分子的活性,可通过调节线粒体相关的信号传导途径来降低氧化应激损伤,调控线粒体功能进而维持细胞正常的生物学功能。作为重要的SIRT3作用底物,叉头框蛋白O3(Forkhead box O3,FOXO3)是一种转录因子,可以通过激活多种基因,介导多种信号通路,涉及能量代谢,氧化应激,蛋白稳态,细胞凋亡,细胞发育,分化代谢过程,自噬和长寿。FOXO3在神经变性性疾病中也起着至关重要的作用,并参与帕金森病的发展。FOXO3是多巴胺能神经元存活的关键因素之一,能够介导相关信号通路,增强神经元对异常聚合α-突触核蛋白消除。我们推测ε-viniferin可能对帕金森病有潜在的治疗价值。本研究拟将6-OHDA作为多巴胺能神经元毒剂,建立SD大鼠的帕金森病模型,阐明ε-viniferin在帕金森病大鼠模型中是否具有神经保护作用,并初步评估其保护作用是否通过抗氧化应激及促进自噬实现;确定ε-viniferin具有潜在治疗作用后,通过鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞毒性损伤建立帕金森病细胞模型,并初步探讨ε-viniferin是否通过增强SIRT3去乙酰化FOXO3作用,促进FOXO3活化并向核内转移,继而调控下游蛋白表达,促进线粒体稳态(线粒体生物发生,分裂融合,线粒体自噬),维持线粒体膜电位,抑制凋亡,抗氧化应激保护神经。研究方法:第一部分,评估ε-viniferin抑制6-OHDA介导的大鼠黑质多巴胺能神经元损伤,建立6-OHDA介导的SD大鼠帕金森病模型并分组。治疗组通过腹腔给药予以不同浓度的ε-viniferin模拟治疗,术后4周予以阿扑吗啡诱导大鼠发生帕金森病行为学改变。免疫荧光TUNEL法评估黑质多巴胺神经元凋亡情况,Western blot评估SOD,BAX,BCL-2,P62蛋白表达情况,免疫荧光评估LC3分布及表达。第二部分,我们进一步评估ε-viniferin通过对SIRT3对FOXO3去乙酰化作用在鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型神经保护作用。以SH-SY5Y细胞为研究对象,建立鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型,采用shRNA抑制SIRT3及FOXO3的表达,Western blot检测SIRT3及FOXO3沉默情况。将ε-viniferin作为治疗药物,实验确定鱼藤酮和ε-viniferin的最佳处理浓度和时间,设计6个不同的处理组。分组后,采用MTT检测细胞生存活力;流式细胞仪检测细胞内活性氧;荧光及流式细胞仪检测线粒体膜电位差异,测定细胞内ATP水平,流式细胞仪通过Annexin V-FITC检测细胞凋亡水平。Western blot检测SIRT3、FOXO3、PGC-1α、TFAM、Drp1、Fis1、Mfn2、Parkin、Nix、Bnip3、P62表达水平。免疫沉淀评估SIRT3对FOXO3去乙酰化作用。提取亚细胞蛋白组分,Western blot检测FOXO3在细胞核,细胞浆及线粒体表达情况。免疫荧光评估SIRT3表达情况。透射电子显微镜观察各组线粒体形态改变及线粒体自噬存在情况。结果:第一部分,ε-viniferin可以改善6-OHDA介导的帕金森病SD大鼠模型的行为学改变。与模型组相比,TUNEL染色提示ε-viniferin可抑制6-OHDA介导的黑质多巴胺能神经元凋亡,促进抗氧化物SOD2表达,同时下调促凋亡蛋白BAX的表达,上调抑制凋亡蛋白BCL-2的表达,同时ε-viniferin可增强自噬相关标志物表达LC3B/A及P62的表达(P<0.05),提示ε-viniferin对6-OHDA介导的黑质多巴胺能神经元保护作用主要是通过抗氧化应激和促进自噬实现。第二部分,MTT实验证实用ε-viniferin处理24小时后可显著提高帕金森病细胞模型的生存率,与模型细胞组相比,可提高40.0±1.8%的细胞活力。但是,当用shRNA预先转染细胞后,干扰SIRT3或FOXO3的表达,ε-viniferin对SH-SY5Y细胞的神经保护作用明显减弱(P<0.05),提示ε-viniferin是通过SIRT3/FOXO3途径保护SH-SY5Y细胞免受鱼藤酮诱导的神经毒性损伤。ε-viniferin能够减轻鱼藤酮诱导的线粒体去极化,降低鱼藤酮诱导的氧化应激,促进ATP的生成,减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡(P<0.05)。但是,干扰SIRT3/FOXO3表达后,上述神经保护效应减弱。我们进一步证实ε-viniferin能够上调SIRT3的表达,促进SIRT3对FOXO3的去乙酰化和FOXO3向核内转移定位。相对于单纯鱼藤酮暴露组,ε-viniferin通过SIRT3促进FOXO3的去乙酰化作用调控线粒体稳态相关蛋白的表达,ε-viniferin能够显著上调促进线粒体生物学发生蛋白(PGC-1α和TFAM表达上升),促进线粒体融合分裂蛋白(Drp1,Fis1及Mfn2表达上升)和调控线粒体自噬相关蛋白(Nix,Bnip3,Parkin表达上升,P62表达下降)。透射电镜检测观察ε-viniferin治疗组形成自噬小体,出现自噬区室,线粒体明显伸长(提示分裂或融合),而在模型组中,细胞的线粒体的内膜面极增大,线粒体嵴增粗,明显渗透性肿胀,提示线粒体凋亡前期表现。结论:我们的研究证实ε-viniferin对帕金森病具有潜在的有神经保护作用,其主要生物学功能是通过增强SIRT3表达,促进SIRT3对FOXO3去乙酰化及调控下游维持线粒体稳态的相关蛋白,主要包括通过促进TFAM和PGC-1α表达,调节线粒体的生物发生;促进Mfn2,Fis1和Drp1以维持线粒体的分裂及融合平衡;上调Parkin,Bnip3和Nix表达诱导线粒体自噬的发生,通过上述途径,ε-viniferin抑制鱼藤酮及6-OHDA诱导的神经毒性,减弱氧化应激损伤,维持线粒体功能,其具有潜在的神经保护作用,为帕金森病的药物治疗开辟新的思路。