第一部分SIAH2在急性T淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞中的定位与表达及与临床指标关系的研究目的:研究泛素连接酶Seven-in-Absentia Homolog 2(SIAH2)在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)骨髓单个核细胞中的定位与表达水平,分析SIAH2表达水平与T-ALL临床指标的关系,初步探讨SIAH2与T-ALL临床表现的关系。方法:收集2011年11月至2015年6月35例初诊急性T淋巴细胞白血病及对照组10例新诊特发性血小板减少症(ITP)患儿骨髓,采用细胞免疫荧光检测T-ALL、ITP骨髓单个核细胞(BMMNCs)及Jurkat细胞中SIAH2的定位与表达;采用荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测T-ALL及ITP BMMNC中SIAH2 m RNA的表达情况;应用细胞免疫组化方法检测T-ALL及ITP BMMNCSIAH2蛋白的表达情况;并对SIAH2m RNA表达水平与临床指标作相关性分析。结果:1)细胞免疫荧光显示,T-ALL BMMNCs及Jurkat细胞胞浆中均可见高亮均匀颗粒状染色的红色荧光,ITP BMMNCs中几乎未见红色荧光表达;2)免疫组化结果显示在初诊T-ALL患儿BMMNCs中SIAH2蛋白阳性表达率为71.4%(25/35),与对照组相比P<0.05);3)q RT-PCR结果显示在初诊T-ALL患儿BMMNCs中SIAH2基因表达水平显著高于对照组(P<0.05);4)SIAH2基因表达水平与T-ALL患儿发生髓外脏器浸润(EMI)密切相关(P<0.05),尤其是与纵膈淋巴结转移及胸腔积液的发生紧密相关(P值均<0.05),而与年龄、性别、初诊时白细胞计数、染色体异常、基因异常、泼尼松诱导缓解及临床危险度分级无显著相关。结论:SIAH2的表达水平在初诊T-ALL患儿BMMNCs中呈高表达,与T-ALL患儿初诊时髓外脏器浸润的发生密切相关,尤其是与纵膈淋巴结转移及胸腔积液的发生紧密相关,提示SIAH2在T-ALL的发生发展中可能起重要作用。第二部分慢病毒靶向干扰SIAH2基因对Jurkat细胞株生物学行为调控作用及机制研究目的:通过慢病毒干扰技术,研究干扰SIAH2基因的表达对Jurkat细胞株增殖、凋亡及侵袭能力的调控作用及机制。方法:实验分组:1)实验组:靶向干扰SIAH2基因慢病毒(Lv-sh SIAH2)转染的Jurkat细胞株;2)空白对照组:Jurkat细胞株;3)阴性对照组:阴性对照慢病毒转染的Jurkat细胞株;采用CCK-8法检测三组Jurkat细胞株的增殖;应用流式细胞学检测三组Jurkat株的细胞周期;采用Annexin V-PE/7-AAD双染法结合流式细胞仪检测三组Jurkat细胞株的凋亡;应用Transwell检测三组Jurkat细胞株侵袭能力的情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测三组Jurkat细胞株上清中VEGF蛋白的表达水平;采用q RT-PCR、Western-blot方法检测SIAH2、P27、Cyclin E1、CDK2、c-myc、BCL2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、MMP-9、MMP-13基因和蛋白表达水平的变化,从基因和蛋白水平观察慢病毒靶向干扰SIAH2基因的表达对Jurkat细胞株中SIAH2基因的干扰的效果,以及干扰SIAH2基因的表达后三组Jurkat细胞株中周期相关分子、凋亡相关分子及侵袭相关分子的表达水平的变化。结果:1)q RT-PCR及Western blot结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,SIAH2基因和蛋白表达水平均明显下降,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;2)CCK-8法结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第4天时,Jurkat细胞的增殖受到抑制,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天时,Jurkat细胞的增殖显著受到抑制,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.001;3)流式细胞学测细胞周期结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第八天,Jurkat细胞中处于G0/G1期细胞比例升高,处于S期细胞比例下降,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;4)Annexin V-PE/7-AAD双染法结合流式细胞仪测细胞凋亡结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,Jurkat细胞的早期凋亡率明显增加,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;5)Transwell结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第八天,穿过Transwell系统小室的Jurkat细胞数量明显下降,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05。6)EIASA结果显示,Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,细胞上清中VEGF蛋白表达量显著降低,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05。7)Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,与增殖相关的蛋白中,P27基因和蛋白表达明显升高,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;c-myc、Cyclin E1的基因和蛋白表达明显降低,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;CDK2基因和蛋白的表达无明显变化,与空白对照组和阴性对照组相比P>0.05;8)Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,其与凋亡相关的分子中Caspase3蛋白表达水平明显升高,BCL2的基因和蛋白水平明显下降,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;9)Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天,其与侵袭相关的分子中VEGF、VEGFR2、MMP-13的基因和蛋白的表达明显降低,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;VEGF、VEGFR1、MMP-13基因和蛋白的表达无明显变化,与空白对照组和阴性对照组相比P>0.05;结论:1)干扰SIAH2基因的表达后能抑制Jurkat细胞的增殖,将Jurkat细胞DNA阻滞在G0/G1期,可能的机制是由于SIAH2基因的干扰上调了P27的基因和蛋白表达水平,同时下调c-myc、cyclin E1的基因和蛋白表达水平,抑制与cyclin E-CDK2复合物的结合,使细胞周期停滞于G0/G1期;2)干扰SIAH2基因的表达能促进Jurkat细胞的早期凋亡,其机制可能是SIAH2基因的干扰上调了Caspase3的蛋白表达水平,同时下调BCL2的基因和蛋白水平,促进Jurkat细胞通过线粒体凋亡途径凋亡;3)干扰SIAH2基因的表达能使Jurkat细胞的侵袭能力下降,可能的机制是SIAH2基因的干扰下调了VEGF、VEGFR2、MMP-13基因和蛋白表达水平,阻断血管新生和细胞外基质降解的重要环节。第三部分慢病毒靶向干扰SIAH2基因对Jurkat细胞株PHD/HIF-1通路影响的研究目的:通过慢病毒干扰技术,研究干扰SIAH2基因的表达对Jurkat细胞株PHD/HIF-1通路影响。方法:实验分组:1)实验组:靶向干扰SIAH2基因慢病毒(Lv-sh SIAH2)转染的Jurkat细胞株;2)空白对照组:Jurkat细胞株;3)阴性对照组:阴性对照慢病毒转染的Jurkat细胞株;分别在正常氧浓度与1%氧浓度条件下培养各组细胞48小时后,采用q RT-PCR、Western-blot方法检测SIAH2基因和蛋白的表达水平,从基因和蛋白水平观察靶向干扰SIAH2基因慢病毒对SIAH2基因干扰的效果,采用Western-blot方法检测SIAH2、PHD1/2/3、HIF-1α蛋白的表达水平以观察干扰SIAH2基因表达后在正常氧浓度与1%氧浓度条件下培养的三组Jurkat细胞中全蛋白中PHD1/2/3和HIF-1α的变化以及核蛋白中HIF-1α的变化。结果:1)Lv-sh SIAH2转染Jurkat细胞第8天时,SIAH2基因和蛋白表达水平均明显下降,与空白对照组和阴性对照组相比P<0.05;2)空白对照组和阴性对照组在1%氧浓度条件下培养48小时后SIAH2、HIF-1α的基因表达水平均无明显变化,与在正常氧浓度条件下相应两组相比P>0.05,空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比无明显差异(P>0.05);3)Lv-sh SIAH2转染第6天的Jurkat细胞,在1%氧浓度、正常氧浓度条件下培养48小时,SIAH2的基因表达水平均显著降低,与空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比P<0.05;HIF-1α的基因表达水平均无显著变化,与空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比P>0.05,SIAH2、HIF-1α的基因表达水平在相应条件下相应两组之间相比无显著差异(P>0.05)。4)空白对照组和阴性对照组在1%氧浓度条件下培养48小时后SIAH2的蛋白表达水平显著升高,PHD1/2/3的蛋白水平明显降低,HIF-1α的蛋白表达水平均显著升高,与正常氧浓度条件下相应两组相比P<0.05,空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比无明显差异(P>0.05);5)Lv-sh SIAH2转染第6天的Jurkat细胞,在1%氧浓度、正常氧浓度条件下培养48小时,SIAH2蛋白表达水平均下降,PHD1/2/3的蛋白水平均升高,HIF-1α的蛋白表达水平均显著降低,与空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比P<0.05;SIAH2、PHD1/2/3、HIF-1α的蛋白表达水平在相应条件下相应两组之间比无明显差异(P>0.05)。6)空白对照组和阴性对照组在1%氧浓度条件下培养48小时后,核蛋白中,HIF-1α的蛋白表达水平显著升高,与正常氧浓度条件下相应两组相比P<0.05,空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比无明显差异(P>0.05);7)Lv-sh SIAH2转染第6天的Jurkat细胞,在1%氧浓度、正常氧浓度条件下培养48小时,核蛋白中,HIF-1α的蛋白表达水平显著降低,与空白对照组和阴性对照组在相应条件下两组相比P<0.05,HIF-1α的蛋白表达水平在1%氧浓度、正常氧浓度条件下两组之间无明显差异(P>0.05)。结论:1)低氧条件下,SIAH2、HIF-1α蛋白的表达上调,PHD蛋白的表达下调,可能的机制是低氧抑制了SIAH2的自降解过程,使其在细胞内积聚,与PHD的特异性结合增多,进而加速PHD的泛素化降解,从而导致HIF-1α不能充分有效的被PHD羟基化,HIF-1α稳定性增加而在细胞内蓄积,促进HIF-1α转位入核,最终激活其下游基因的转录;2)在1%氧浓度、正常氧浓度条件下,干扰SIAH2基因的表达后均能够上调PHD蛋白的表达,下调HIF-1α蛋白的表达,可能的机制是SIAH2基因的干扰,使其编码的SIAH2的蛋白减少,进而使PHD的泛素化降解减少,从而促进了HIF-1α的羟基化以破坏了HIF-1α的稳定性,加速HIF-1α经泛素化降解,引起HIF-1α入核减少,最终抑制其下游基因的转录;3)在Jurkat细胞中,SIAH2主要是从蛋白水平调控PHD、HIF-1α的表达激活PHD/HIF-1信号通路,影响细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为。