铁蛋白和血蓝蛋白都是含有金属离子的多功能蛋白,能直接或者间接的参与生物体内重金属离子的脱毒作用,并参与生物体多种生理生化的反应以及各种金属蛋白和酶类的合成。当生物体遭受病原微生物感染时,铁蛋白和血蓝蛋白在生物体的表达量,都有上调的趋势,可见与机体的免疫密切相关。铁蛋白是由蛋白外壳和铁核中心组成的一个具有独特笼状类似于球状病毒的结构,其生物学基本功能是在生物体内储存和释放铁离子,有效调节细胞内铁离子浓度,维持铁离子在细胞内的代谢平衡,避免机体内产生铁中毒。鲍的铁蛋白与脊椎动物的铁蛋白相似,具有两个不同的多肽链亚基,分别为铁蛋白亚基1(Abalone ferritin subunit 1, AbFe1)和铁蛋白亚基2(Abalone ferritin subunit 2, AbFe2)。血蓝蛋白是动物界中第二大类载氧蛋白,主要分布在软体动物的腹足类、头足类及节肢动物的甲壳类等的血淋巴细胞中。鲍血蓝蛋白( Ablone hemocyanin,AbHc)是由二十聚体形成的中凹圆柱型结构,与单孔螺血蓝蛋白结构相似具有两个不同的亚基AbHc1和AbHc2,每个亚基都有8个功能单位(Functional units),分别命名为a～h,分子量约为400KDa。研究表明,a～h功能体之间的氨基酸序列的同源性超过45%,不同的功能体可能由同一蛋白分子进化而来。本研究选取鲍铁蛋白两个亚基AbFe1、AbFe2的ORF序列和鲍血蓝蛋白AbHcH1亚基中FU-d、FU-h功能单位部分序列AbHc-d和AbHc-h,进行原核表达,以弗氏佐剂乳化目的蛋白,采取肌肉多点注射的方法免疫实验兔;经4～5次免疫之后,获得分别抗AbFe1、AbFe2、AbHc1d和AbHc1h的四个抗血清。经Western blot检测表明,抗AbFe1、AbHc1d重组表达蛋白的抗体效价较低,而抗AbFe2和AbHc1h的特异性比较好,AbFe1的抗体能识别AbFe2蛋白;另外,AbHc1h和AbHc1d的各自抗体都能相互识别AbHc1h和AbHc1d蛋白。为了进一步验证抗体的识别的特异性,采用50%和33%饱和硫酸铵分级沉淀纯化抗血清,并以宿主菌的丙酮提取物去除抗体与宿主菌交叉性反应的抗体本底。将经饱和硫酸铵粗纯化的抗体进行Western blot,本底明显降低,抗体损失较小,而以宿主菌丙酮提取物去除本底后,抗体效价大为降低。同时为了探讨了抗体与抗原结合的最佳工作浓度以及在蛋白亚基之间的抗体识别的特异性,采用电洗脱的方法回收表达的目的蛋白,通过酶联免疫吸附(ELISA)筛选AbHc1d、AbHc1h抗血清与抗原的最佳结合浓度,结果显示抗血清最佳稀释倍数为1000倍,抗原浓度分别4μg/mL、2μg/mL。在确定抗体与抗原最佳结合浓度的基础上,进行这两个蛋白与各自抗体的竞争性ELISA实验,检测抗体的特异性及非特异识别的程度。本研究通过制备铁蛋白亚基AbFe1、AbFe2和血蓝蛋白AbHcH1亚基的FU-d、FU-h功能体的多克隆抗体,检测蛋白多聚体亚基之间的识别特异性,为进一步验证鲍宿主在病原菌侵染下,其机体内铁蛋白和血蓝蛋白多聚体结构是否产生异构体做了一定的前期工作。