中国对虾氧位—甲基转移酶基因克隆、表达分析与功能研究

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病害一直是困扰水产养殖业的最大问题,研究水产养殖品种的抗病相关基因,利用其本身的抗病因子加强抗病力,发展新的免疫防治对策,取代或减少药物使用是水产养殖品种病害防治的根本。本论文从细菌刺激的中国对虾中克隆了一个氧位-甲基转移酶基因,从细菌刺激的泥鳅中克隆了一个CD59基因,并对这两个基因进行了表达模式和功能研究,结果如下: 一、首次克隆了中国对虾COMT基因 儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,简称COMT,E.C.2.1.1.6)是一种氧位-甲基转移酶。尽管氧位-甲基转移酶转甲基的化学机制都是一样的,但由于甲基受体分子的不同,氧位-甲基转移酶的种类也有所不同。动物有两种氧位-甲基转移酶被广为研究:一种是法呢酸-氧位-甲基转移酶(famesoic acid-O-methyltransferase,简称FAMeT):另一种就是COMT。通过对甲壳动物FAMeT的研究得知,FAMeT是催化法呢酸甲基化反应生成法呢酸甲酯的氧位-甲基转移酶,对甲壳动物的生长、卵巢发育和蜕皮具有调控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一个甲基转移到含儿茶酚结构的底物分子上,形成甲基化的产物,所以,COMT可以灭活儿茶酚胺类以及其它的儿茶酚型化合物,当然,也包括含有儿茶酚结构的有毒物质和临床药物。 自从1958年人的COMT被首次发现以来,COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现,然而,关于甲壳类COMT的研究还未见报道。 本文利用抑制性消减杂交技术(SSH)和SMART cDNA方法,克隆了中国对虾COMT基因,该基因全长cDNA序列已提交给GenBank,登录号为DQ091255。中国对虾COMT基因全长917bp,含有一个完整的开放阅读框,编码的成熟肽由221个氨基酸组成,其理论分子量是24572.06 Da,等电点是5.27,推测该成熟肽有10个磷酸化的氨基酸位点,不具信号肽,说明中国对虾COMT不分泌到循环的血液中,而是依赖特定氨基酸的磷酸化起调控作用。另外,推测中国对虾COMT中第18-221个氨基酸残基构成了一个保守区,该保守区属于甲基转移酶-3家族。 甲基转移酶-3家族成员很多,包括COMT、细菌氧位-甲基转移酶(简写为OMT)和咖啡酰辅酶A-氧位-甲基转移酶(简写为CCoAOMT)。通过氨基酸序列比对发现,本文克隆的中国对虾COMT基因与人和其它的哺乳动物的COMTs具有较高的的同源性,而与甲壳动物十足目的FAMeTs没有重要的序列相似性。系统发育分析也将本文克隆的中国对虾COMT基因与其它物种的COMTs归为同一类群,而与甲壳动物的FAMeTs分属不同类群,依此推论中国对虾氧位-甲基转移酶基因不属于FAMeTs,而
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