H9N2亚型低致病性禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）不仅对家禽存在一定的致病性,而且已有报道表明H9N2亚型AIV可跨种感染人类,同时也可作为一些新型流感病毒的基因供体,具有引发流感大流行的潜力。PA-X蛋白作为PA基因核糖体移码产生的新型蛋白,目前认为是H9N2亚型AIV的毒力因子,而且与宿主天然免疫调控密切相关。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为重要的抗原递呈细胞,同时也是调控宿主天然免疫应答的关键。H9N2亚型AIV的PA-X蛋白是否能够调控DCs天然免疫功能,进而影响其对禽类和哺乳动物的致病性仍尚不明确。本研究首先构建了 H9N2亚型AIV PA-X缺失株及作为参照的H1N1亚型流感病毒PA-X缺失株,并在体内外水平比较了母本株和PA-X缺失株对哺乳动物的致病性差异;其次,评估了母本株和PA-X缺失株对小鼠原代体外DCs和体内鼻腔黏膜DCs的天然免疫应答的影响;最后,成功建立了鸡骨髓源DCs的体外诱导培养模型,并初步探索了 H9N2亚型AIV母本毒株和PA-X缺失株对鸡DCs天然免疫应答的影响。本研究首次从树突状细胞层面解析PA-X蛋白对哺乳动物和禽类宿主天然免疫的影响,为揭示H9N2亚型AIV致病机理提供了依据。1.H9N2亚型AIV PA-X缺失株的构建及其对哺乳动物的致病性研究基于 H9N2 亚型 AIV A/chicken/Taixing/10/2010（rTX）、H1N1 亚型流感病毒 A/Puerto Pico/8/1934（rPR8）母本株,通过点突变和反向遗传技术成功构建了AIV PA-X缺失株rTX-ΔPAX和rPR8-ΔPAX,Western blot试验验证PA-X蛋白敲减或缺失成功,并进一步评价了上述毒株在体内外对哺乳动物的致病性。结果显示,PA-X缺失后减弱了 H9N2亚型AIV在MDCK上早期的生长复制水平。体内小鼠致病性试验表明,与母本毒株相比,感染PA-X缺失的H9N2亚型AIV和H1N1亚型流感病毒的肺脏病理损伤减弱,肺脏病毒载量及炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IP-10表达水平显著降低。因此,PA-X蛋白显著增强了 H9N2亚型AIV对哺乳动物的致病性。2.H9N2亚型AIV PA-X缺失株对小鼠树突状细胞天然免疫的影响首先体外诱导培养小鼠骨髓源DCs,通过光学显微镜观察和流式细胞术鉴定,结果显示,培养的细胞具有典型的树突结构,纯度高达91.7%,在LPS刺激下可以高表达CD86,使DCs由未成熟状态成功转变为成熟状态,因此,诱导培养的DCs符合要求。随后将母本毒株（rTX、rPR8）和PA-X缺失株（rTX-ΔPAX、rPR8-ΔPAX）分别感染鼠DCs,通过流式细胞术检测发现,PA-X缺失后,H9N2和H1N1亚型病毒对DCs的感染能力显著增强,且DCs的形态指数、表型标志（CD80、CD86、CD40、MHCII）、早期活化标志（CD69）、迁移标志（CCR7）的表达均显著增加;同时,促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α表达量显著增加,抗炎细胞因子IL-10的表达量显著减少。DCs与CD4+T淋巴细胞的混合淋巴反应试验结果显示,病毒以MOI=0.5的剂量感染DCs后,以DCs:T=1:1或1:5的比例与CD4+T细胞共培养,PA-X缺失病毒感染的DCs可以显著刺激CD4+T细胞的增殖。最后,通过将各重组病毒滴鼻感染小鼠,结果发现,PA-X缺失后,H9N2亚型AIV可以显著促进小鼠鼻腔黏膜及引流淋巴结处的DCs募集,参与此过程的DCs主要为CD11b+亚型。以上结果表明,H9N2亚型AIV PA-X蛋白能够显著抑制小鼠DCs的天然免疫应答水平。3.H9N2亚型AIV PA-X缺失株对鸡树突状细胞天然免疫的影响首先应用重组鸡GM-CSF、IL-4细胞因子联合诱导培养鸡骨髓源DCs,通过光学显微镜观察和流式细胞术鉴定,结果显示,培养的细胞呈典型的集落方式生长且具有明显的树突结构,在LPS诱导下,表型标志CD40、CD86的表达均显著增加。以上结果表明鸡骨髓源DCs诱导培养体系建立成功,可用于后续试验。其次,将母本毒株H9N2亚型AIV rTX和PA-X缺失株rTX-ΔPAX感染鸡DCs,通过流式细胞术检测发现,PA-X缺失后,H9N2对鸡DCs的感染和刺激鸡DCs成熟的能力均显著增强,表现为NP蛋白、鸡DCs表型标志（CD86、CD40、MHCII）的表达显著增加;同时,鸡DCs分泌IL-6、IL-12、IL-1β的水平显著提高,分泌IFN-α、IL-10的水平显著下降。以上结果初步表明,H9N2亚型AIV PA-X蛋白抑制鸡DCs的天然免疫水平。