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目的:构建裂解型腺病毒载体,研究其体内外治疗人肝癌细胞及其转移瘤的效果和机理。方法:抽提QBI-293A细胞的基因组DNA,根据Genebank公布的第5血清型腺病毒(Ad5)的E1A基因序列设计并合成一对引物,采用PCR技术克隆人E1A基因,将其亚克隆到pUCm-T载体并鉴定。以测序正确的pUCm-T-E1A为模板,酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack-CMV上,形成重组载体pAdTrack-CMV-E1A。重组载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到的重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-E1A经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A细胞,获得重组裂解型腺病毒rAd-E1A。rAd-E1A感染人肝癌细胞HepG2, SMMC-7721和人正常肝细胞HL-7702,显微镜下观察rAd-E1A对细胞的裂解效果,MTT法和流式细胞仪检测rAd-E1A对细胞生长抑制和诱导凋亡作用。RT-PCR和Western-blotting鉴定rAd-E1A的作用机理。在nu/nu裸鼠皮下建立SMMC-7721人肝癌的动物模型,观察rAd-E1A基因治疗肝癌的效果,并进一步研究其机理。在小白鼠腹水型肝癌H22基因治疗模型中,检测rAd-E1A对小白鼠免疫器官(胸腺,脾脏)和免疫细胞(白细胞,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞)的影响。MTT法检测rAd-E1A对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的影响,ELISA检测对ECV304细胞分泌血管内皮生长因子VEGF的影响,Western-blotting鉴定rAd-E1A对ECV304细胞的NF-κB。结果:成功获得1194bp的E1A基因及其上游开放可译框架(ORF),序列测定结果与GenBank报道的完全一致。并成功构建了裂解型腺病毒rAd-E1A,可显著裂解人肝癌细胞HepG2, SMMC-7721,诱导细胞的凋亡,抑制细胞生长,而对人正常肝细胞HL-7702作用较弱。rAd-E1A可体内抑制人肝癌和小鼠腹水型肝癌的生长,且对小白鼠的免疫器官没有抑制,同时可提高中性粒细胞和单核细胞的数目。rAd-E1A在人肝癌细胞中上调Fas,Bax,下调survivin和Bcl-2的表达,另外在人肝癌组织中上调凋亡相关因子p53,p27,caspase-3,下调血管生成相关因子VEGF和CD34的表达。rAd-E1A明显抑制ECV304内皮细胞增殖和下调VEGF和NF-κB的表达。