研究背景与目的弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的一类非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL），约占成人NHL的30％-40％，是一种具有侵袭性、生长迅速并具有临床异质性的中高度恶性淋巴瘤，WHO分类标准中分出了多个形态学亚型，患者有各种分子生物学、遗传学改变，临床疗效、预后和转归均有很大差异。尽管联合化疗能使40％～50％的患者达到持续缓解，但仍有许多DLBCL患者不能缓解或缓解后复发。如果能找到有效的预测疗效或复发的指标，对预后欠佳的病例接受更为积极的治疗，将有助于改善疗效和预后。目前临床上评估预后使用较为普及的是国际预后指数（international prognostic Index，IPI）。IPI根据年龄、行为状态、Ann Arbor分期、LDH水平和结外累及病变获得的国际预后指数评分将患者分为低危、中低危、中高危和高危，对指导分层治疗、判断预后转归具有重要意义。然而IPI仅是一些临床指标的结合，文献报道低危、中低危、中高危和高危组患者各组之间5年总生存率并没有显著差别，IPI具有一些局限性，不能反应肿瘤的分子生物学特征。但目前弥漫性大B细胞淋巴瘤异质性的分子机制仍不清楚，B细胞终末成熟分化依赖于许多转录因子的调控，对该过程中重要转录因子的研究有助于揭示其异质性的本质，可能为弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗提供新靶点、新途径。干扰素调节因子-4（interferon regulation factor-4，IRF4／MUM1）是一种骨髓瘤相关癌基因，是干扰素调节因子家族中的成员，较其它成员特异表达于淋巴细胞。IRF4属于转录因子的一种，在基因调控中起重要作用，其异常表达是由于t（6；14）（p25；q32）染色体异位，即IRF4异位到第14号染色体I g H增强子位点，导致MUM1蛋白过表达，从而促进肿瘤形成。IRF4／MUM1能促进成纤维母细胞的转化以及其缺失的淋巴细胞凋亡增加均提示其癌基因的范畴。既往资料表明IRF4在大多数多发性骨髓瘤患者中异常表达。近来研究报道IRF4／MUM1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中有50％-75％的阳性率，但其与预后的关系目前仍不能确定。为明确IRF4／MUM1与DLBCL临床预后的关系，深入探讨DLBCL的发病机制，以及寻找治疗DLBCL新方法和新途径，我们进行了这方面的研究。研究分两部分进行，第一部分为临床研究，以临床确诊的DLBCL病人为研究对象，免疫组化方法检测IRF4的表达情况并观察IRF4阳性及阴性患者的生存期，探讨IRF4的表达与DLBCL的预后关系。第二部分为体外研究，以B淋巴瘤细胞株Namalwa和Daudi为研究对象，利用不同浓度的阿霉素联合万珂（Velcade）作用于细胞株，探讨转录因子IRF4在其中的表达及与化疗药物耐药的关系，同时观察蛋白酶体抑制剂Velcade对IRF4的影响，为临床治疗提供理论依据。研究对象与方法1、收集河南省肿瘤医院和上海交通大学医学院附属瑞金医院2001—2005年经病理确诊的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者及其病理腊块标本，患者共有95例，男性58例，女性37例；年龄18-84岁，中位年龄51岁。免疫组织化学方法探讨IRF4的表达情况，将患者分为IRF4（+）组和IRF4（-）组，随访两组患者，探讨2年无病生存率和总生存率有无差别。2、B细胞淋巴瘤Namalwa和Daudi细胞株培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱，两天传代一次。3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验应用96孔细胞培养板，每孔接种2×10⁴个细胞于200μl RPMI1640培养体系中，分别加入不同浓度的阿霉素（0、5、10、20、30、50、100ng／ml）；对于Namalwa细胞株，Velcade 15nM联合加入不同浓度的阿霉素组。每种用药浓度设三复孔并设不加药的对照组，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养48小时后，每孔加入5mg／ml MMT 20μl继续培养6小时，取出2000转／分离心10分钟，小心吸弃培养液，加入200μlDMSO，振荡溶解后于570nm波长酶标仪测定各孔的光密度值（OD），计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制率=（对照组OD值-加药组OD值）／对照组OD值]。4、AnnexinV检测凋亡：不同浓度的阿霉素和Velcade及两药联合进行细胞凋亡刺激后，收集并洗涤细胞，用AnnexinV-FITC方法标记，随即应用流式细胞仪分析AnnexinV-FITC标记的待检细胞凋亡情况。5、抽提RNA收集Daudi和Namalwa细胞株以及Namalwa细胞株不同用药组（阿霉素50ng／ml、Velcade15nM和两药联合）、不同用药时间（12、24、48、72小时）的细胞各3×10⁶，常规Trizal法抽提总体RNA。分光光度仪测量RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA质量。6、RT-PCR和半定量RT-PCR检测IRF4的基因表达20μl体系取2.5μg总体RNA用逆转录酶M-MLV合成cDNA。取2μl cDNA进行PCR反应扩增IRF4基因，β-globin做为对照。具体方法参照操作指南。IRF4的引物序列是5’-AGAACGAGGAGAAGAGCATC-3和5’-CCTTTAAACAGTGCCCAAG-3’，PCR产物为114bp；β-globin的引物序列是5’-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’和5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’，PCR产物为216bp。7、Western杂交检测IRF4蛋白表达收集Daudi和Namalwa细胞株以及Namalwa细胞株不同用药组（阿霉素50ng／ml、Velcade15nM和两药联合）、不同用药时间（12、24、48、72小时）的细胞3×10⁶，用100μlLaemmli缓冲液（62.5mM Tris-HCl pH 6.8，10％glycerol，2％SDS，5％β-mercaptoethanol）裂解15分钟，煮沸10分钟，-80℃冻存。取20μg蛋白在含SDS的10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳，在Mini Trans-Blot Cell中电转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂牛奶封闭2小时，加IRF4抗体1：500和β-actin抗体1：20000在水平摇床上4℃孵育过夜。经TBST漂洗3次×5分钟，在水平摇床上孵育辣根过氧化物酶偶联的二抗（SantaCruz）1：2000室温1小时。TBST漂洗3次×5分钟。按试剂说明书用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate进行化学发光显影，用X光片记录影像。β-actin作为内参调节不同样品的上样量。结果：1、转录因子IRF4在DLBCL患者中的表达情况：免疫组织化学方法分析在95例弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中，58例表达IRF4，表达率为61.1％，将患者按年龄、行为状态评分、Ann Arbor分期、结外病变累及数目、LDH水平高低以及国际预后指数评判的危险度分组，研究IRF4／MUM1表达在各组分布情况及与上述临床资料的相关性，结果显示IRF4／MUM1表达与患者的年龄、Ann Arbor分期、结外病变累及数目、LDH高低以及国际预后指数确定的疾病危险度相关，而与行为状态评分无关，它们主要表达于年龄大于60岁、Ann Arbor分期Ⅲ／Ⅳ、结外病变累及数目大于1个、LDH升高以及国际预后指数评价中高危和高危的患者。2、转录因子IRF4对DLBCL患者预后影响：95例患者首次治疗均行6-8个周期的CHOP方案为主的化疗，可随访患者66例随访6-44个月，中位随访时间24个月。Kaplan-Meier生存分析显示，IRF4／MUM1阳性患者的2年无病生存率和总体生存率分别为38.2％（±9.1％）和62.9％（±10.3％），IRF4／MUM1阴性患者的2年无病生存率和总体生存率分别为68.2％（±11.8％）和84.4％（±10.4％），IRF4／MUM1阳性患者的2年无病生存率显著低于阴性患者（P=0.0053），但总体生存率两者未显示显著差别（P=0.0694）。3、转录因子IRF4在细胞株中的表达用RT-PCR和Western杂交方法检测转录因子IRF4在Daudi和Namalwa细胞株中的表达发现，Namalwa细胞株表达IRF4基因和蛋白，而Daudi细胞株中未检测出IRF4基因和蛋白的表达。4、单药阿霉素对两种细胞株生长抑制的影响MTT结果分析显示不同浓度的阿霉素（0、5、10、20、30、50ng／ml）作用48小时对Daudi细胞的生长抑制率显著高于Namalwa细胞株，具有统计学分析差异（P＜0.05）。以上结果说明Namalwa细胞株比较Daudi细胞株对常用的淋巴瘤治疗药物阿霉素存在一定程度的耐药。5、阿霉素联合Velcade对Namalwa细胞株生长抑制和凋亡的影响Namalwa细胞株对不同浓度的阿霉素较Daudi细胞显示一定程度的耐药，我们观察新型抗肿瘤药蛋白酶体抑制剂Velcade对这种耐药的拮抗作用。将Velcade15nM加入不同浓度阿霉素（0、5、10、20、30、50ng／ml）培养48小时对细胞生长的抑制率分别为26％、42％、41.3％、64.1％、82％、88.2％，显著高于单药阿霉素的抑制率0、2.87％、4.9％、28.2％、39.2％、58.3％（P＜0.05）；单药阿霉素浓度50ng／ml时的凋亡率为23.9％，单药Velcade浓度15nM时的凋亡率分为59.8％，与Velcade联合用药后为75.9％，Velcade与阿霉素联合Velcade的凋亡百分率显著高于单药阿霉素，两者比较也具有统计学差异性（P＜0.01）。上述结果说明Velcade能够克服Namalwa细胞株对阿霉素的耐药。6、单药阿霉素、Velcade和阿霉素联合Velcade对IRF4表达的影响为进一步研究Namalwa细胞株耐药和Velcade克服耐药与IRF4表达的关系，选择单药阿霉素50ng／ml、Velcade15nM以及两种药物联合作用Namalwa细胞株12、24、48、72小时后IRF4基因和蛋白表达的变化。结果发现单药阿霉素组各用药时间IRF4基因和蛋白均未发生明显变化；单药Velcade组12、24小时IRF4基因表达无明显变化，48小时基因表达开始下调，72小时出现IRF4蛋白表达下调；两药联合组24小时即开始出现IRF4基因表达的下调，48小时随之出现蛋白表达的下调。说明Velcade克服Namalwa细胞株对阿霉素的耐药部分通过下调IRF4表达起作用。结论：1、IRF4在半数以上DLBCL中表达，其表达者预后较不表达者差，可以作为DLBCL的不良预后指标。2、体外细胞株研究发现IRF4转录因子与DLBCL传统化疗耐药相关。3、蛋白酶体抑制剂Velcade增强阿霉素对Namalwa细胞的生长抑制及促凋亡作用，可能通过下调IRF4的表达逆转了其对阿霉素的耐药；4、IRF4可能成为DLBCL治疗的新靶点。