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滋养细胞是一种特殊类型的胎盘细胞,在胚胎着床和母胎界面的形成中起着重要作用。胚泡植入子宫内膜后,滋养层细胞分化为绒毛外滋养层细胞和绒毛膜滋养层细胞。绒毛外滋养层细胞在侵袭蜕膜间质和子宫血管中起着关键作用。有两种类型的绒毛膜滋养层细胞:外层的合胞滋养层细胞和内层的细胞滋养层细胞。合胞滋养细胞位于绒毛膜表面,直接参与母婴间的物质交换。细胞滋养层细胞位于内层,具有较强的增殖能力,在一定条件下可分化为绒毛外滋养层细胞和合胞滋养层细胞。滋养细胞增殖和凋亡之间的动态平衡对维持妊娠至关重要,这种平衡的破坏可能导致并发症,如子痫前期或流产。国内外研究表明,自然流产患者滋养细胞凋亡指数明显高于正常妊娠。纤维连接蛋白1（Fibronectin 1,FN1）是一种高分子量糖蛋白,具有多种生物学功能。FN1存在于细胞外基质中,在细胞粘附、生长、迁移和分化中起关键作用,并参与维持细胞形态。FN1在子宫肌瘤中显著上调,与滋养细胞侵袭、子宫内膜增殖和粘附功能有关。然而,FN1对滋养层细胞的作用及其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨FN1在滋养层细胞中的表达及其分子机制。第一部分生物信息学分析显示FN1调控滋养细胞的增殖与凋亡目的:通过对GEO中GSE127170数据集进行分析,发现参与滋养细胞分化的关键基因和通路。方法:GSE127170数据集进行分析,此数据集包括12个样本,分别是未处理的JEG-3细胞与forkolin处理的JEG-3细胞、未处理的BeWo细胞与forkolin处理的BeWo细胞、未处理的JEG-3和BeWo细胞与forkolin处理的JEG-3和BeWo细胞。首先对DEGs进行分析,继而进行PPI网络的构建及hub基因的鉴定,最后进行基因富集（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析得到基因本体（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路,结果:1.在GSE127170数据集的基因集1中,数据集分析显示903个差异表达基因（DEGs）（410个P＜0.05和|logFC|＞1）,包括493个上调和410个下调基因。共鉴定出17个重叠的Hub基因:LYN原癌基因、scr家族酪氨酸激酶（scr family tyrosine kinase,LYN）、纤维连接蛋白 1（fibronectin1,FN1）等。2.在 GSE127170数据集的基因集2中,数据集分析显示共有440个差异的基因（DEGs）,包括260个上调的基因和180个下调的基因。共鉴定出16个重叠的Hub基因:Yes相关蛋白1（Yes associated protein 1,YAP1）、整合素亚单位 α1（integrin subunit alpha 1,ITGA1）、纤维连接蛋白1（fibronectin 1,FN1）等。3.在GSE127170数据集的基因集3中,数据集分析显示共有388个差异表达基因（DEG）,包括238个上调基因和150个下调基因。共鉴定出15个重叠的Hub基因:胎盘生长因子（placental growth factor,PGF）、集落刺激因子 1 受体（colony stimulating factor 1 receptor,CSF1R）、和 FN1 等。4.GO和KEGG富集分析发现,TGFB1、FN1和KLF4是来自基因集1、基因集2和基因集3的重叠Hub基因。FN1主要富集于磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB）（PI3K/Akt）信号通路。TGFB1、FN1 和KLF4 主要富集在 ERK1和 ERK2 级联（regulation ERK1 and ERK2 cascade）、损伤反应（response to wounding）、阿米巴样细胞迁移（ameboidal-type cell migration）、细胞因子产生负调节（negative regulation of cytokine production）、血管发育（blood vessel development）、细胞粘附调节（regulation of cell adhesion）、胚胎形态发生（embryonic morphogenesis）、血管形态发生（blood vessel morphogenesis）,以及调节细胞因子的产生（regulation of cytokine production）等通路。结论:生物信息学分析表明,TGFB1、FN1和KLF4是参与滋养细胞增殖和凋亡调控的关键基因。GO和KEGG分析表明,FN1主要影响PI3K/Akt信号通路,参与细胞增殖和凋亡。第二部分FN1在SA患者胎盘绒毛组织中下调并且调节JEG-3和BeWo细胞的增殖和凋亡目的:检测FN1在人胎盘绒毛组织和滋养层细胞中的表达及意义方法:1.搜集自然流产者（SA组）和人工流产者（IA组）各65例,取胎盘绒毛组织,HE染色观察组织病理学变化。2.免疫组化实验检测SA组和IA组患者胎盘绒毛组织中FN1的表达。3.实时荧光定量PCR检测患者血清中FN1的mRNA表达量。4.在人滋养层细胞JEG-3和BeWo中通过转染FN1或者siFN1来上调或下调FN1的表达量,蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测转染效率。5.CCK-8法检测细胞活力。6.流式细胞仪检测细胞凋亡。7.蛋白质印迹法检测细胞中Cleaved Caspase-3,Bax,Bcl-2,PCNA 和 Ki67 的表达量。8.Pearson’s x2分析FN1的表达与SA患者临床特征的关系。结果:1.HE实验结果显示IA组绒毛组织形态无明显变化,内层细胞滋养层细胞呈立方形、多角形或椭圆形,边界清晰,胞浆透明。相反,SA组绒毛组织形态发生明显改变,镜检可见绒毛组织有不同程度的退行性变、增生和变性SNHG15在胶质瘤组织中显著高表达。2.相较于IA组,SA组的胎盘绒毛组织和周围组织仅显示弱的FN1染色。3.SA组患者血清FN1 mRNA水平显著低于IA组。4.FN1表达与年龄（P=0.314）或妊娠周期（P=0.718）无关。5.在JEG-3和BeWo细胞中,上调FN1的表达均可以显著增强细胞活力,下调FN1的表达均可以抑制细胞活力。6.在JEG-3和BeWo细胞中,上调FN1的表达均可以显著抑制细胞凋亡,下调FN1的表达均可以显著增加细胞凋亡。7.在JEG-3和BeWo细胞中,下调FN1的表达均可以显著促进Cleaved Caspase-3和Bax的表达并显著抑制Bcl-2,PCNA和Ki67的表达,相对地,上调FN1的表达均可以显著抑制Cleaved Caspase-3和Bax的表达并显著增加Bcl-2,PCNA 和 Ki67 的表达。结论:FN1在SA患者胎盘绒毛组织中表达下调,FN1通过调节增殖和凋亡相关蛋白的表达来调控滋养层细胞的活性和凋亡。第三部分FN1通过激活PI3K/Akt信号通路来调节JEG-3和BeWo细胞的活性和凋亡目的:探讨FN1影响滋养层细胞JEG-3和BeWo细胞的活性和凋亡的分子机制。方法:1.蛋白质印迹法检测转染后的JEG-3和BeWo细胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的表达量。2.通过PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002和激活剂IGF-1分别对转染后的JEG-3（NC/FN1）和BeWo（siNC/siFN1）细胞进行处理。3.CCK-8法检测细胞活力。4.流式细胞仪检测细胞凋亡。5.蛋白质印迹法检测细胞中Cleaved Caspase-3,Bax,Bcl-2,PCNA 和 Ki67 的表达量。结果:1.在滋养层细胞JEG-3和BeWo中,上调FN1的表达促进PI3K和Akt的磷酸化。2.在JEG-3和BeWo细胞中,LY294002和IGF-1的处理均可以成功恢复FN1表达量变化对滋养层细胞活力的影响。3.在JEG-3和BeWo细胞中,LY294002和IGF-1的处理均可以成功恢复FN1表达量变化对滋养层细胞凋亡的影响。4.在JEG-3和BeWo细胞中,阻断PI3K/Akt信号通路均可以恢复FN1表达量变化对Cleaved Caspase-3,Bax,Bcl-2,PCNA 和 Ki67 等表达的影响。结论:FN1通过激活PI3K/Akt信号通路来调节JEG-3和BeWo细胞的活性和凋亡。第四部分FN1基因敲除影响SA小鼠绒毛组织滋养层细胞凋亡目的:探讨FN1在体内对于滋养层细胞凋亡的影响。方法:1.根据不同的处理,将小鼠分为将孕鼠随机分为正常妊娠组（NP）、自然流产组（SA）、正常妊娠FN1-/-小鼠组（FN1-/-）和自然流产FN1-/-小鼠组（FN1-/-SA）等四组,每组6只,诱导流产后处死小鼠,并收集绒毛进行进一步的实验。2.HE染色观察NP,FN1-/-,SA,FN1-/-SA等四组组小鼠绒毛组织的组织病理学变化。3.实时荧光定量PCR对NP,FN1-/-,SA,FN1-/-SA等四组组小鼠绒毛组织中FN1的表达量进行检测。4.我们通过免疫组化实验对NP,FN1-/-,SA,FN1-/-SA等四组组小鼠绒毛组织中Cleaved Caspase-3阳性细胞的比例进行的检测。结果:1.FN1-/-组的绒毛组织的组织病理学改变多于NP组,但低于SA和FN1-/-SA组。FN1-/-SA组绒毛组织的病理变化大于SA组。2.小鼠绒毛组织中FN1表达水平在NP、SA、FN1-/-和FN1-/-SA组中按顺序逐渐降低。3.SA小鼠模型或FN1敲出可增加绒毛组织中Cleaved Caspase-3表达水平,FN1敲除进一步增加SA小鼠绒毛组织中Cleaved Caspase-3表达水平。结论:FN1在体内影响绒毛组织的病理学变化和细胞凋亡。