论文部分内容阅读
裂褶多糖(Schizophyllan,SPG)是由裂褶菌子实体或发酵液提取得到的一种中性多糖,其在抗肿瘤、机体免疫调节、抗氧化、抗炎、保湿等方面均表现出良好的活性。作为药食同源植物,葛根(Radix Puerariae,RP)富含多糖、葛根素、异黄酮、皂苷等活性成分,具有抗氧化、抗炎、降血糖、解酒护肝等作用。本文采用液体双向发酵技术,以裂褶菌为发酵菌株,以药性基质葛根为营养基质进行发酵,制备裂褶菌葛根发酵产物,发现在增加裂褶多糖产量的同时,促进了发酵液抗氧化、抗衰老活性的增强,为裂褶菌的综合利用提供实验数据和理论依据。(1)裂褶菌-葛根液体双向发酵条件优化以裂褶菌菌丝体生物量及胞外多糖产量为评价指标,从四种药食同源植物中筛选出最佳营养基质葛根,控制培养基初始pH为6.0、葛根添加量10.00 g/L、接种量5.0%,于28℃,160 r/min发酵6.0 d,发酵产物胞外多糖产量为4.86±0.11 g/L,紫外光谱(Ultra violet,UV)和傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)表明,植物基质葛根的添加未影响SPG的化学结构。当控制培养基初始pH为5.40、葛根添加量为12.80 g/L、接种量为10.00%时,裂褶多糖产量为8.41±0.12 g/L,与未添加葛根基质的空白对照组裂褶多糖产量(6.76±0.52 g/L)相比,添加葛根基质后裂褶多糖的产量显著提高,为空白对照组的1.24倍。(2)裂褶菌葛根发酵液活性成分含量测定及抗氧化活性成分鉴定以裂褶菌发酵液(Schizophyllum commune fermented supernatants cultured from regular medium,SC)为空白对照组,对裂褶菌葛根发酵液(Schizophyllum commune fermented supernatants cultured from Radix puerariae supplemented medium,SC-RP)的活性成分含量、抗氧化活性进行研究。当发酵液中裂褶多糖浓度为6.76 g/L时,SC-RP中总蛋白含量为4.66±0.05 g/L、总多酚含量为3731.56±54.07 mg GAE/100 g,FW、总黄酮含量为27.97±0.41 mg CE/100 g,FW,均显著高于空白对照组SC(p<0.05)。SC-RP中总多酚、总黄酮含量分别增加至空白对照组的12.94和3.30倍。通过四种不同化学抗氧化评价体系(Fenton法、ABTS+法、FRAP法和ORAC法),证明SC-RP总抗氧化能力显著增强(p<0.05),且SC-RP的FRAP值和ORAC值分别增加至空白对照组的14.69倍和11.56倍。相关性分析表明:SC-RP的体外抗氧化能力与总多酚、黄酮成分高度相关(r>0.90)。利用HPLC-MS/MS技术对SC-RP活性成分进行分析,与SC相比,SC-RP中共鉴定出8种关键性抗氧化活性物质:葛根素、染料木苷、染料木素、拟雌内酯、白藜芦醇、异丹叶大黄素、秦皮乙素和香叶木素,其中葛根素、染料木苷、染料木素、拟雌内酯来源于葛根基质;白藜芦醇、异丹叶大黄素、秦皮乙素和香叶木素为双向发酵过程中生物转化所生成新的活性成分。(3)裂褶菌葛根发酵液抗衰老活性研究在秀丽隐杆线虫衰老模型实验中,未添加SC-RP的空白对照组平均寿命为16.27±1.34 d,SC-RP中剂量组(10μg/mL)、高剂量组(20μg/mL)能分别延长线虫平均寿命至20.32±0.88 d和20.38±1.30 d,寿命延长率分别为24.89%和25.26%。SC-RP还能降低线虫体内肠脂褐质的积累,改善线虫中、老年时期的运动能力,并提高线虫在过氧化氢应激、百草枯应激和热应激等胁迫状态下的抗应激能力。此外,裂褶菌葛根发酵液还能够显著提高线虫体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并降低氧化副产物硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和活性氧(ROS)的积累(p<0.05),表现出显著的抗衰老活性。(4)裂褶菌葛根发酵液抗衰老作用机制借助突变型线虫(daf-16,age-1,clk-1,mev-1,skn-1)和转基因型线虫(LD1,CF1553和TJ356)模型,进一步探讨了裂褶菌葛根发酵液抗衰老作用机制。中剂量组SC-RP(10μg/mL)可以显著上调抗衰老关键基因daf-2、gst-4和sod-3基因的表达水平,下调daf-16、skn-1和clk-1基因的表达水平(p<0.05);促进DAF-16和SKN-1蛋白的入核以及抗氧化相关蛋白SOD-3的表达(p<0.05)。与对照组相比,SC-RP对daf-16、skn-1和clk-1线虫的平均寿命无显著性影响(p>0.05),提示daf-16、skn-1和clk-1基因可能是影响裂褶菌葛根发酵液产生抗衰老活性的关键基因。以上结果表明,SC-RP可通过胰岛素信号通路、SKN-1/Nrf2通路以及线粒体代谢通路,发挥延缓线虫衰老的作用。